이 프로토콜은 후생 유전학 메틸화 마커를 기반으로 정확한 차동 백혈구 계수를 허용하는 유연한 멀티플렉스 물방울 PCR 워크플로우를 제공합니다. 이러한 유연성은 임상 사용을 향한 mdPCR의 번역을 용이하게 할 수 있다. 이 방법은 면역 형광 염색 방법을 사용하여 얻은 사람들에게 밀접하게 쿼리하는 결과를 제공합니다.
그러나 면역형성 염색과는 달리, 그러나, 이 방법은 신선한 혈액 견본 또는 비용이 많이 드는 항체를 요구하지 않습니다. 혈액학적 진단에서 차동 백혈구는 감염, 염증, 빈혈 및 백혈병을 포함한 다양한 질병의 지표로 작용할 수 있으며 조기 예후암 바이오마커로 간주되고 있습니다. 압델라만 엘만잘라위와 함께 절차를 시연하는 것은 NRC의 의료기기 연구 센터의 기술 책임자인 크리스티나 나시프(Christina Nassif)가 될 것입니다.
단백질 키나아제 K의 마이크로리터 20과 400 마이크로리터의 리시스 결합 버퍼를 자기 구슬을 포함하는 400 마이크로리터를 PBS의 100 마이크로리터에 새로 해동된 인간 말초 혈액 단핵세포와 철저히 혼합하여 시작합니다. 실온에서 5분 간 인큐베이션을 한 후, 체퍼를 제거하기 전에 튜브를 자기 랙에 1~2분 간 놓습니다. 자석에서 제거된 튜브를 사용하여, 특별히 결합되지 않은 구슬을 제거하기 위해 600 마이크로리터의 세척 버퍼 1에서 DNA 비드 복합체를 다시 중단합니다.
튜브를 자석에 다시 놓고 상체를 제거할 수 있도록 한 후, 600 마이크로리터의 세척 버퍼 2에서 세포를 세척합니다. 상체를 제거한 후, 튜브가 자석에서 1분 동안 공기 건조를 한 후 100 마이크로리터의 용출 버퍼를 튜브에 철저한 혼합으로 추가하도록 합니다. 이어서, 자기 용액을 1~2분 동안 자기 랙에 놓고 자기 구슬을 암시된 DNA로부터 분리하고, 정제된 DNA 용액을 새로운 튜브로 옮기다.
정제된 DNA의 비황핏 변환을 위해, 암시된 DNA 샘플의 20마이크로리터를 PCR 튜브로 옮기고, 130마이크로리터의 변환 시약을 튜브로 추가한다. 철저한 혼합 후 튜브 내용물들을 잠시 회전시키고 열 사이클러에서 DNA를 증폭시합니다. 주기의 끝에서, 수집 튜브에 배치 된 이온 크로마토그래피 컬럼에 결합 버퍼의 600 마이크로 리터를 추가하고, 컬럼에 DNA를 추가합니다.
튜브를 여러 번 반전하여 혼합하고 원심분리기를 최대 속도로 30초 동안 사용합니다. 수집된 흐름을 폐기하고 100마이크로리터의 세척 버퍼를 열에 추가합니다. 컬럼을 원심분리하고 설명한 대로 흐름을 다시 버립니다.
실온에서 15~20분 동안 열에 200마이크로리터의 데술포네이션 버퍼를 넣고 샘플을 원심분리하고 설명한 대로 흐름을 폐기합니다. 다음으로, 세척당 200 마이크로리터의 세척 버퍼로 컬럼을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브로 옮기고 100 마이크로리터의 PCR 급 물을 컬럼 막에 추가합니다.
그런 다음, 전신속도로 1분 동안 컬럼의 원심분리로 DNA를 엘테한다. 액적 생성을 위해 비황피테 변환 된 DNA 의 마이크로 리터 1 개를 PCR 튜브에 새로 준비 된 프로브 마스터 믹스와 혼합하고 간단한 원심 분리로 샘플을 수집합니다. 피크 피팅을 사용하여 일회용 유체 튜브를 250 마이크로리터 볼륨 정밀 유리 주사기 2개에 연결합니다.
그리고 5%의 밀가루 계면활성제를 함유한 250마이크로리터의 정밀 유리 주사기 1개, 캐리어 오일 50마이크로리터가 포함된 정밀 유리 주사기 1개를 미리 채웁니다. 두 주사기를 모두 적재하면 PCR의 100 마이크로리터를 캐리어 오일 주사기에 넣고, 고속 카메라가 장착된 직립 광 현미경의 단계에 액적 미세 유체 장치를 놓습니다. 실시간으로 액적 형성의 관찰 및 기록을 위해 미리 채워진 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 배치하고 피팅과 피크 조합을 사용하여 주사기의 튜브를 액적 미세 유체 장치의 각 입구 채널의 튜브에 연결합니다.
물방울 발생기의 출구에서 0.5 밀리리터 PCR 튜브의 안쪽으로 튜브를 배치하고, 주사기 펌프 유량을 분당 2마이크로리터로 조정하여 액적 크기가 안정화되어 에멀젼을 수집합니다. 튜브 상단에서 천천히 조심스럽게 에멀젼을 수집하고 용액의 75 마이크로리터를 200 마이크로리터 PCR 튜브로 이송하여 열 사이클링을 합니다. 그런 다음 PCR 튜브의 오일 함량이 분산 된 상의 부피와 밀접하게 일치하고 열 순환 중에 물방울의 결합을 방지하고 200 마이크로 리터 튜브를 열 사이클러에 배치합니다.
유화 된 샘플의 형광 이미징의 경우 PCR 에멀젼을 직사각형 프로파일이있는 50 마이크로 미터 깊이의 보로실리케이트 모세관 튜브로 전송하여 액적액을 가까운 단일 층으로 배열하여 이미징을 위한 밀폐 된 단층으로 배열할 수 있습니다. 모세혈관을 현미경 슬라이드에 고정하고 밀봉한 후 슬라이드를 반전 된 현미경의 단계에 로드합니다. 현미경 이미징 소프트웨어에서 실시간 카메라 수집을 시작하기 위해 빠르게 획득하고 라이브를 선택합니다.
그런 다음, 밝은 필드 및 형광 현미경 검사의 밑에 견본을 관찰합니다. 액적 생성 및 열 사이클링에 이어, 액적은 1밀리미터 너비와 50마이크로미터 높이의 유리 모세관에 도입될 수 있습니다. 형광 이미지 획득에 이상적인 액적의 단층 분포를 얻으려면 각 파장에 대해 이미지를 기록할 수 있습니다.
이미지 분석 후, 각각의 형광에 있는 모든 액적물의 형광 강도는 양수 및 음수 액적의 임계값을 확립하기 위해 플롯될 수 있다. 식별 및 계수 후, 액적 값당 사본을 계산할 수 있으며, CD3+T-셀 및 CD4+25+조절 T-셀의 백분율은 총 세포 또는 C-less 유전자의 액적당 사본과 관련하여 각각 메틸화 CD3Z 및 FOXP3 사본에 따라 결정될 수 있다. 백분율 값은 그 때 적당한 항체를 사용하여 면역 형광 화상 진찰을 통해 얻은 것과 비교될 수 있습니다.
나는 열 사이클링및 최종 액적 이미징 단계를 통해 액적 생성에서 에멀젼 안정성이 정확하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 정량화 결과를 얻는 데 중요하다고 생각합니다. 맞춤형 PCR 혼합 제형을 통한 MD PCR 커스터마이징은 단일 세포 수준에서 암 연구, 전염병 진단 및 분석을 포함한 다수의 응용 분야에 사용될 수 있다.
