Этот протокол представляет собой гибкую мультиплексную капельку PCR рабочий процесс, который позволяет точное дифференциальное количество лейкоцитов на основе эпигенетических маркеров метилирования. Такая гибкость может облегчить перевод mdPCR в сторону клинического использования. Этот метод дает результаты, которые тесно запрос для тех, кто получил с помощью иммунофлуоресцентных методов окрашивания.
Однако, в отличие от иммунофлуоресцентного окрашивания, этот метод не требует свежих образцов крови или дорогостоящих антител. В гематологической диагностике дифференциальные лейкоциты могут служить индикаторами спектра заболеваний, включая инфекцию, воспаление, анемию и лейкемию, и рассматриваются в качестве раннего прогностического биомаркера рака. Демонстрацией процедуры с Абдельрахман Эльманзалави будет Кристина Насиф, технический сотрудник нашей команды в Научно-исследовательском центре медицинского устройства NRC.
Начните с тщательного смешивания 20 микролитров белковой киназы K и 400 микролитров буфера связывания лиза, содержащего магнитные бусины со свежеоттаями моноядерными клетками человеческой периферической крови в 100 микролитров PBS. После пятиминутной инкубации при комнатной температуре поместите трубку на магнитную стойку в течение одной-двух минут, прежде чем удалить супернатант. С трубкой удалены из магнита, повторно приостановить ДНК бисером комплекса в 600 микролитров мыть буфера один, чтобы удалить любые не специально связанные бусы.
Поместите трубку обратно на магнит, чтобы удалить супернатант, перед мытьем клеток в 600 микролитров мыть буфера два, как только что продемонстрировали. После удаления супернатанта, дайте трубке высохнуть на магните в течение одной минуты, прежде чем добавить 100 микролитров буфера элюции в трубку с тщательным смешиванием. Затем поместите трубку на магнитную стойку на одну-две минуты, чтобы отделить магнитные бусы от ссылаемой ДНК и перенести очищенный раствор ДНК в новую трубку.
Для преобразования бисульфита очищенной ДНК перенесите 20 микролитров ссылаемого образца ДНК в трубку ПЦР и добавьте в трубку 130 микролитров реагента преобразования. После тщательного смешивания, кратко спина вниз содержимое трубки и усилить ДНК на тепловой циклер. В конце цикла добавьте 600 микролитров связывающего буфера в ионный хроматографический столбец, помещенный в коллекторную трубку, и добавьте ДНК в столбец.
Переверните трубку несколько раз, чтобы смешать, и центрифугу в течение 30 секунд на полной скорости. Отбросьте собранный поток через, и добавьте 100 микролитров буфера мытья к столбецу. Центрифуга колонны и отбросить поток через снова, как попродемонстрировано.
Добавьте 200 микролитров буфера десульфонации в столбец для инкубации за 15-20 минут при комнатной температуре, прежде чем центрифугировать образец и отказаться от протекания, как это было продемонстрировано. Далее, мыть колонку два раза с 200 микролитров мыть буфера на стирку. После второй стирки перенесите колонку в новую трубку сбора 1,5 миллилитров и добавьте 100 микролитров воды класса ПЦР в мембрану колонны.
Затем, elute ДНК центрифугации столбца в течение одной минуты на полной скорости. Для генерации капель смешайте один микролитр бисульфит-преобразованной ДНК со свежеприготовленной смесью мастера зонда в трубке ПЦР и соберите образец с краткой центрифугой. Используйте пиковые фитинги для подключения одноразовых жидкостных труб до двух 250-микролитровых точных стеклянных шприцев.
И предварительно заполнить один точный стеклянный шприц с 250 микролитров несущего масла, содержащего 5%flouro surfactant, и один точный стеклянный шприц с 50 микролитров масла перевозчика. Когда оба шприца были загружены, загрузите 100 микролитров смеси ПЦР в шприц несущего масла и поместите капельное микрофлюидное устройство на сцену вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой. Для наблюдения и записи образования капель в режиме реального времени поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприц-насос, а также используйте пиковый союз с фитингами для подключения труб шприцев к трубе соответствующих входных каналов микрофлюидного устройства капли.
Поместите трубки из розетки генератора капель на внутреннюю сторону 0,5 миллилитров ПЦР трубки, и настроить скорость потока шприц насоса до двух микролитров в минуту, чтобы размер капли стабилизироваться перед сбором в результате эмульсии. Медленно и осторожно собирайте эмульсию из верхней части трубки и перенесите 75 микролитров раствора в 200 микролитровую трубку ПЦР для теплового езды на велосипеде. Затем подтвердите, что содержание масла в ПЦР-трубке близко соответствует объему рассеянной фазы, чтобы предотвратить слияние капель во время теплового цикла, и поместите 200 микролитровую трубку в тепловой циклер.
Для флуоресценции изображения эмульгированного образца, передача эмульсии ПЦР в 50-микрометровую борозиликатную капиллярную трубку с прямоугольным профилем, чтобы позволить расположение капель в тесно упакованный монослой для визуализации. После фиксации и уплотнения капилляров на слайд микроскопа загрузите слайд на стадию перевернутого микроскопа. И в микроскоп изображения программного обеспечения, выберите приобрести и жить быстро, чтобы начать в режиме реального времени приобретение камеры.
Затем наблюдайте за образцом под яркой полевой и флуоресцентной микроскопией. После генерации капель и теплового цикла капли могут быть введены в стеклянную капиллярную капиллярную систему шириной в один миллиметр и высотой 50 микрометров. Чтобы получить монослойное распределение капель, идеально подходит для получения изображения флуоресценции, изображения могут быть записаны для каждой длины волны.
После анализа изображений флуоресценция всех капель в соответствующих флюорофорах может быть установлена для установления порога положительных и отрицательных капель. После идентификации и подсчета копий значения капли могут быть рассчитаны, а процент CD3-T-клеток и CD4-25-регулятивных Т-клеток может быть определен на основе метилированных копий CD3 и FOXP3 соответственно, по отношению к копиям на каплю общей клетки или C-менее гена. Процентные значения можно сравнить с значениями, полученными с помощью иммунофлуоресценции изображений с использованием соответствующих антител.
Я думаю, что стабильность эмульсии от генерации капель через тепловой цикл и заключительные шаги по визуализации капель имеет решающее значение для получения точных, надежных и воспроизводимых результатов количественной оценки. MD PCR настройки с помощью индивидуальных ПЦР смесь формулировка может быть использована для ряда приложений, включая исследования рака, диагностики инфекционных заболеваний и аналитики на одном уровне клеток.
