Edhazardia aedis هو طفيلي microsporidian الذي يصيب على وجه التحديد Aedes aegypti البعوض. يمكن أن يكون تربية هذا الطفيلي تحديًا للباحثين الجدد بسبب تعقيد دورة حياة الطفيلي. يوفر هذا البروتوكول تعليمات خطوة من الحكمة لتربية E.aedis، بما في ذلك كيفية توقيت الخطوات بشكل صحيح إلى الإجراء، وتحديد الجراثيم المعدية، ونشر الجيل القادم من الطفيليات.
يمكن أن يكون التوقيت الدقيق لهذا البروتوكول صعبًا وقد يتطلب بعض التجربة والخطأ. كما أن تحديد الجراثيم قد يكون صعباً. وينبغي أن توفر المساعدات البصرية في هذا البروتوكول المساعدة.
للبدء ، يفقس بيض A.Aegypti المصاب بE.aedis عن طريق وضعها في صينية تربية اليرقات مع لتر واحد من الماء غير المؤين وإضافة 50 ملليغرام من طعام السمك. بيت البعوض في 27 درجة مئوية والرطوبة النسبية 80٪ مع ضوء 14 ساعة، دورة داكنة 10 ساعة. بعد الفقس ، قلل من كثافة اليرقات إلى ما يقرب من 100 يرقة لكل صينية ، مما يجعل الصواني الجديدة عند الضرورة.
أضف قطعة من طعام القط الجاف إلى كل صينية. تجديد الغذاء عند استنفاد ولكن لا توفر أي الغذاء الزائد. قطعة واحدة 200 ملليغرام من الغذاء القط كل ثلاثة أيام كافية.
عندما تكون اليرقات المصابة هي الثالثة إلى الرابعة من النجوم ، تفقس بيض A.aegypti المصاب في صينية جديدة. تربية البعوض في كثافات مثل أن A.aegypti صحية تصل إلى الثانية إلى الثالثة في وقت 48 إلى 72 ساعة. يمكن أن تضمن مجموعات الفقس من البيض السليم على مدى عدة أيام أن اليرقات في المرحلة الصحيحة عند الحاجة.
لحصاد وقياس الجراثيم غير النوى، استخدم ماصة نقل لنقل 10 يرقات رابعة مصابة إلى أنبوب ميكروسنتريفوغ 1.5 ملليلتر. إزالة مياه التكاثر مع ماصة نقل وغسل اليرقات مرة واحدة عن طريق إضافة ما يقرب من ملليلتر من المياه النظيفة الأيونية. إزالة مياه الغسيل وإضافة 500 ميكرولتر من المياه النظيفة الأيونية إلى اليرقات 10 والتجانس لهم باستخدام الحشرات والمجانسة الميكانيكية.
تحميل 10 ميكرولترات من تجانس على قياس الهيموسيت وقياس الجراثيم في التكبير 400X. جعل الطين الغذائي اليرقات الطازجة عن طريق خلط 1.2 غرام من مسحوق الكبد، 0.8 غرام من خميرة بروير، و 100 ملليلتر من الماء. نقل 100 ثانية إلى ثالثة فيستار صحية A.aegypti اليرقات إلى 150 ملليلتر الكؤوس أو أكواب العينة وإضافة خمس مرات 10 إلى الرابعة إلى واحدة مرات 10 إلى الجراثيم الخامسة إلى كل كوب مع ماصة.
إضافة مليلترين من الطين الغذائي اليرقات والمياه الأيونية لحجم النهائي من 100 ملليلتر. بعد 12 إلى 24 ساعة من التعرض ، قم بنقل اليرقات إلى صواني تربية. إضافة الطعام والخلف لهم إلى مرحلة البلوغ.
مراقبة اليرقات البيدة للتبّن ونقل الخراء إلى كوب ظهور في قفص. السكر تغذية الكبار الإعلانية libitum. دم تغذية البالغين وفقا للبروتوكولات القياسية المتاحة من خلال موارد BEI.
جمع البيض من البالغين الذين يغذون الدم. يحدث الإرسال الرأسي لـ E.aedis في هذه الخطوة. عند الانتهاء، تنظيف جميع المواد التي جاءت في اتصال مع E.aedis مع 10٪ التبييض ولصناعة السيارات لمنع التلوث.
يوضح هذا البروتوكول الإجراء الكامل اللازم لنشر E.aedis في بعوض A.aegypti. تم تفقيس بيض A.aegypti المصاب بـ E.aedis وتربية اليرقات إلى المرحلة الرابعة من النجوم. في المرحلة الرابعة من النجوم ، يمكن ملاحظة علامات بصرية للعدوى مثل sporocysts البيضاء في جميع أنحاء الهيئات الدهنية لليرقات المصابة.
تم حصاد الجراثيم الأحادية من يرقات النجوم الرابعة عن طريق تجانس 10 يرقات في 500 ميكرولتر من المياه الأيونية. وكانت هذه الجراثيم piriform و مرئية بسهولة في التكبير 400X. تم حساب عدد بوغ من 4050 جراثيم لكل ميكرولتر واستخدمت هذه الجراثيم لتصيب اليرقات السليمة عن طريق انتقال أفقي.
تم تقييم حالة العدوى وكميات E.aedis من 25 يرقة جيل البنية في سبعة أيام بعد الفقس. تم العثور على معدل العدوى العمودية من E.aedis في جيل البنوية أن يكون 96٪، ومتوسط الحمل بوغ من الأفراد المصابين في سبعة أيام بعد الفقس كان 3.31 مرات 10 إلى الخامس. لتنسيق التدريج اليرقات بشكل صحيح ، من المستحسن أن تأخذ في الاعتبار بعض التقلبات في وقت تربية اليرقات.
بالإضافة إلى ذلك، فإن أعداد البوغ تزداد بسرعة، لذا إذا لم تكتشف الجراثيم، فما عليك سوى المحاولة مرة أخرى في اليوم التالي. حظ سعيد.
