エダリア・アエディスは、Aedes aegypti蚊に特異的に感染する微小胞体寄生虫である。この寄生虫の飼育は、寄生虫のライフサイクルの複雑さのために、新しい研究者にとって困難な場合があります。このプロトコルは、手順のステップを適切に時間を取り、感染性胞子を特定し、次世代の寄生虫を伝播する方法を含む、E.aedisを飼育するためのステップワイズの指示を提供します。
このプロトコルの正確なタイミングは困難であり、試行錯誤が必要な場合があります。胞子の識別も困難です。このプロトコルの視覚補助機能は、支援を提供する必要があります。
まず、E.aedisに感染したA.Aegyptiの卵を1リットルの脱イオン水で幼虫飼育トレイに入れ、50ミリグラムの魚の食べ物を加えることによって孵化させます。蚊を摂氏27度、相対湿度80%で14時間光、10時間の暗いサイクルで収容します。孵化後、幼虫の密度をトレイあたり約100個まで下げ、必要に応じて新しいトレイを作ります。
各トレイに乾いたキャットフードを1個ずつ加えます。枯渇したら食べ物を補充するが、余分な食品を提供しない。3日ごとに200ミリグラムのキャットフードで十分です。
感染した幼虫が3番目から4番目の星である場合、感染していないA.aegypti卵を新しいトレイに孵化させる。健康なA.aegyptiが48〜72時間で2番目から3番目のインスターに達するように密度で蚊を飼育します。複数の日にわたって健康な卵の孵化バッチは、幼虫が必要なときに正しい段階であることを保証することができます。
単核胞子を収穫し定量化するには、移管ピペットを使用して、感染した10個の第4インスター幼虫を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移動します。移管ピペットで繁殖水を取り除き、約1ミリリットルのきれいな脱イオン水を加えて幼虫を1回洗います。洗浄水を取り除き、10の幼虫に500マイクロリットルのきれいな脱イオン水を加え、害虫と機械ホモジナイザーを使用して均質化します。
ホモジネート10マイクロリットルをヘモサイトメーターに積み込み、400倍の倍率で胞子を定量化します。1.2グラムの肝臓粉末、0.8グラムのブルワー酵母、100ミリリットルの水を混合して、新鮮な幼虫食品スラリーを作ります。100秒から3番目のインスター健康なA.aegypti幼虫を150ミリリットルのビーカーまたは標本カップに移し、ピペットで各カップに5回10〜1回10回を加えます。
100ミリリットルの最終体積のために幼虫食品スラリーと脱イオン水の2ミリリットルを追加します。12~24時間の暴露後、幼虫を飼育トレイに移します。食べ物を加え、大人に育てる。
子犬のためのドーズされた幼虫を監視し、ケージ内の出現カップに子犬を転送します。砂糖は大人のアドリビタムを供給します。血液は、BEIリソースを通じて利用可能な標準的なプロトコルに従って成人を供給します。
血液を与えられた大人から卵を収集します。E.aedisの垂直伝送はこのステップで起こります。終了したら、10%漂白剤とオートクレーブでE.aedisに接触したすべての材料を洗浄して汚染を防ぎます。
このプロトコルは、A.aegypti蚊にE.aedisを伝播するために必要な完全な手順を示しています。E.aedisに感染したA.aegypti卵は孵化し、幼虫は第4のインスター段階に飼育された。第4段階では、感染した幼虫の脂肪体全体に白い胞子のような感染の視覚徴候が観察された。
単核胞子は、500マイクロリットルの脱イオン水で10頭の幼虫を均質化することによって、第4のインスター幼虫から採取した。これらの胞子は、ピリフォームであり、400倍の倍率で容易に見える。マイクロリットル当たり4,050個の胞子数を計算し、これらの胞子を使用して水平感染を介して健康な幼虫に感染させた。
25の親膜発生幼虫の感染状態およびE.aedis負荷を、孵化後7日間で評価した。親交生成におけるE.aedisの垂直感染率は96%であり、孵化後7日間の感染者の平均胞子負荷は3.31倍から5回目であった。幼虫のステージングを適切に調整するには、飼育時間の変動を考慮することをお勧めします。
さらに、胞子数は急速に増加するので、胞子を検出しない場合は、次の日にもう一度やり直してください。がんばって。
