Edhazardia aedis özellikle Aedes aegypti sivrisinek enfekte bir mikrosporidian parazittir. Bu parazitin yetiştirilmesi, parazitin yaşam döngüsünün karmaşıklığı nedeniyle yeni araştırmacılar için zor olabilir. Bu protokol, E.aedis'in yetiştirilmesi için, prosedürün adımlarını nasıl düzgün bir şekilde zamanlandırılabilmek, bulaşıcı sporları belirlemek ve yeni nesil parazitleri yaymak da dahil olmak üzere adım adım talimatlar sağlar.
Bu protokolün doğru zamanlaması zor olabilir ve bazı deneme yanılma gerektirebilir. Sporları tanımlamak da zor olabilir. Bu protokoldeki görsel yardımlar yardım sağlamalıdır.
Başlamak için, yumurta A.Aegypti yumurta E.aedis ile enfekte bir litre deiyonize su ile bir larva yetiştirme tepsisine yerleştirerek ve balık gıda 50 miligram ekleyerek. 14 saat ışık, 10 saatlik karanlık döngüsü ile 27 santigrat derece ve% 80 bağıl nem sivrisinek ev. Yumurtadan çıktıktan sonra larva yoğunluğunu tepsi başına yaklaşık 100 larvaya düşürün ve gerektiğinde yeni tepsiler yapın.
Her tepsiye bir parça kuru kedi maması ekleyin. Tükenmiş gıda doldurmak ama herhangi bir fazla gıda sağlamaz. Her üç günde bir 200 miligram kedi maması yeterlidir.
Enfekte larvalar üçüncü ila dördüncü yıldız olduğunda, yeni bir tepsiiçine enfekte edilmemiş A.aegypti yumurtaları yumurtadan. Sivrisinekleri, sağlıklı A.aegypti'nin 48-72 saat içinde ikinci ila üçüncü yıldıza ulaşması gibi yoğunluklarda arka. Birden fazla gün boyunca sağlıklı yumurta kuluçka parti rırvaları gerektiğinde doğru aşamada olduğunu garanti edebilir.
Uninucleate sporlarını hasat etmek ve ölçmek için, 10 enfekte dördüncü yıldız larvasını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne taşımak için bir transfer pipeti kullanın. Bir transfer pipet ile Üreme suyu çıkarın ve temiz deiyonize su yaklaşık bir mililitre ekleyerek bir kez larvayı yıkayın. Yıkama suyunu çıkarın ve 10 larvaya 500 mikrolitre temiz deiyonize su ekleyin ve bir havaneli ve mekanik bir homogenizer kullanarak homojenize edin.
Bir hemositometre üzerine homojen 10 mikrolitre yükleyin ve 400X büyütme de sporları ölçmek. 1,2 gram karaciğer tozu, 0,8 gram Brewer mayası ve 100 mililitre suyu karıştırarak taze larva gıda bulamacı yapın. 150 mililitrelik gagalar veya numune bardak içine üçüncü instar sağlıklı A.aegypti larva 100 saniye transfer ve bir pipet ile her fincan beşinci sporlar için bir kez 10 dördüncü beş kez 10 ekleyin.
100 mililitre lik son bir hacim için iki mililitre larva gıda bulamacı ve deiyonize su ekleyin. 12 ila 24 saat maruz kaldıktan sonra larvaları yetiştirme tepsilerine aktarın. Yiyecek ekleyin ve yetişkinliğe geri.
Yavrulama için dosed larvaları izleyin ve pupayı kafesteki bir çıkış kabına aktarın. Şeker yem yetişkinler reklam libitum. BEI Resources aracılığıyla mevcut standart protokollere göre kan besleme yetişkinler.
Kanla beslenen yetişkinlerden yumurta toplayın. E.aedis'in dikey iletimi bu adımda gerçekleşir. Bittiğinde, kontaminasyonu önlemek için E.aedis ile temas eden tüm malzemeleri %10 çamaşır suyu ve otoklavlama ile temizleyin.
Bu protokol, A.aegypti sivrisineklerinde E.aedis'i yaymak için gerekli prosedürü niçin gösterdiğini göstermektedir. E.aedis ile enfekte olmuş A.aegypti yumurtaları yumurtadan çıkmış ve larvalar dördüncü yıldız evresine kadar yetiştirilmiştir. Dördüncü instar aşamasında, enfekte larvaların yağ organları nda beyaz sporocysts gibi enfeksiyon görsel belirtileri görülebilir.
Uninucleate sporları, 500 mikrolitre deiyonize suda 10 larvayı homojenleştirerek dördüncü yıldız larvalarından hasat edildi. Bu sporlar piriform ve kolayca 400X büyütme görülebilir. Mikrolitre başına 4.050 spor hesaplandı ve bu sporlar yatay iletim yoluyla sağlıklı larvaları enfekte etmek için kullanıldı.
Enfeksiyon durumu ve 25 filial nesil larva yükleri kuluçkadan sonra yedi gün değerlendirildi. Filial jenerasyonda E.aedis'in dikey enfeksiyon oranı %96 olarak saptanmış ve yumurtadan çıkma dan sonra yedi gün içinde enfekte bireylerin ortalama spor yükü 3.31 çarpı 10 ile beşinci arasındadır. Larva evrelemesini düzgün bir şekilde koordine etmek için, yetiştirme süresinde bazı değişkenlikler göz önünde bulundurulması tavsiye edilir.
Ayrıca, spor numaraları hızla artar, bu nedenle sporları tespit etmezseniz, ertesi gün tekrar deneyin. İyi şanslar.
