Edhazardia aedis est un parasite microsporidien qui infecte spécifiquement les moustiques Aedes aegypti. L’élevage de ce parasite peut être difficile pour les nouveaux chercheurs en raison de la complexité du cycle de vie du parasite. Ce protocole fournit des instructions pas à pas pour l’élevage de l’E.aedis, y compris la façon de bien mettre à l’heure les étapes de la procédure, d’identifier les spores infectieuses et de propager la prochaine génération de parasites.
Le moment précis de ce protocole peut être difficile et peut nécessiter des essais et des erreurs. Il peut également être difficile d’identifier les spores. Les aides visuelles de ce protocole devraient fournir une assistance.
Pour commencer, éclosez les œufs A.Aegypti infectés par l’E.aedis en les plaçant dans un plateau d’élevage larvaire avec un litre d’eau déionisée et en ajoutant 50 milligrammes de nourriture pour poissons. Abritez les moustiques à 27 degrés Celsius et à 80 % d’humidité relative avec un cycle sombre de 14 heures de lumière et de 10 heures. Après l’éclosion, réduire la densité des larves à environ 100 larves par plateau, ce qui rend de nouveaux plateaux au besoin.
Ajouter un morceau de nourriture sèche pour chats à chaque plateau. Reconstituer les aliments lorsqu’ils sont épuisés, mais ne fournissent pas d’excès de nourriture. Un morceau de 200 milligrammes de nourriture pour chats tous les trois jours est suffisant.
Lorsque les larves infectées sont de troisième à quatrième stades, éclosez des œufs A.aegypti non infectés dans un nouveau plateau. Élever les moustiques à des densités telles que la santé A.aegypti atteindre deuxième à troisième instar en 48 à 72 heures. L’éclosion de lots d’œufs sains sur plusieurs jours peut garantir que les larves sont au bon stade au besoin.
Pour récolter et quantifier les spores de uninucléate, utilisez une pipette de transfert pour déplacer 10 larves infectées de quatrième stade vers un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Retirer l’eau de reproduction à l’l’l’œur d’une pipette de transfert et laver les larves une fois en ajoutant environ un millilitre d’eau déionisée propre. Retirer l’eau de lavage et ajouter 500 microlitres d’eau déionisée propre aux 10 larves et les homogénéiser à l’aide d’un pilon et d’un homogénéisateur mécanique.
Chargez 10 microlitres d’homogénéisation sur un hémocytomètre et quantifiez les spores à 400X grossissement. Faire une boue alimentaire larvaire fraîche en mélangeant 1,2 grammes de poudre de foie, 0,8 grammes de levure de bière et 100 millilitres d’eau. Transférer 100 secondes à la troisième moitié des larves saines d’A.aegypti en 150 millilitres ou tasses à spécimens et ajouter cinq fois 10 à la quatrième à une fois 10 à la cinquième spores à chaque tasse avec une pipette.
Ajouter deux millilitres de boue alimentaire larvaire et de l’eau déionisée pour un volume final de 100 millilitres. Après 12 à 24 heures d’exposition, transférer les larves dans des plateaux d’élevage. Ajouter la nourriture et les élever à l’âge adulte.
Surveiller les larves dosées pour la pupation et transférer les pupes dans une tasse d’émergence dans une cage. Sucre nourrir les adultes ad libitum. Les adultes nourris au sang selon les protocoles standard disponibles par l’intermédiaire de BEI Resources.
Recueillir les œufs des adultes nourris au sang. La transmission verticale d’E.aedis se produit à cette étape. Une fois terminé, nettoyez tous les matériaux qui sont entrés en contact avec E.aedis avec 10% d’eau de Javel et d’autoclaving pour éviter la contamination.
Ce protocole démontre la procédure complète nécessaire pour propager e.aedis chez les moustiques A.aegypti. Les œufs A.aegypti infectés par l’E.aedis ont été éclos et les larves ont été élevés au quatrième stade de l’instar. Au quatrième stade, des signes visuels d’infection ont pu être observés, comme des sporocystes blancs dans l’ensemble des graisses des larves infectées.
Les spores uninucléaires ont été récoltées à partir de larves de quatrième stade en homogénéisant 10 larves dans 500 microlitres d’eau déionisée. Ces spores étaient piriformes et facilement visibles au grossissement de 400X. Un nombre de spores de 4050 spores par microlitre a été calculé et ces spores ont été utilisées pour infecter les larves saines par transmission horizontale.
L’état de l’infection et les charges d’E.aedis de 25 larves de génération filiale ont été évalués à sept jours après l’éclosion. Le taux vertical d’infection d’E.aedis dans la génération filiale s’est révélé être 96%et la charge moyenne de spores des individus infectés à sept jours après l’éclosion était 3.31 fois 10 à la cinquième. Pour coordonner correctement la mise en scène larvaire, il est conseillé de tenir compte d’une certaine variabilité dans le temps d’élevage.
En outre, le nombre de spores augmente rapidement, donc si vous ne détectez pas les spores, il suffit d’essayer à nouveau le lendemain. Bonne chance.
