يسمح هذا الإجراء للباحثين البعوض لمعالجة بسهولة اللياقة البدنية البعوض الإنجابية على المستوى الفردي. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، يقلل هذا البروتوكول بشكل كبير من الوقت والمكان والعمل اللازم لاختبار براز البعوض وخصوبتها على المستوى الفردي. ابدأ بإعداد لوحات لتجربة oviposition.
حفر أربعة إلى ستة ثقوب لكل بئر في غطاء لوحة ثقافة 24 بئرا باستخدام الحفر المنزلية مع بت 1.6 ملليمتر. قبل يوم واحد من التجربة، اغسل وشطف الأطباق وانقعها في 1٪ إلى 5٪ تبييض لمدة 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، شطف لوحات جيدا تحت تشغيل المياه deionized وتجفيفها.
تذوب 2٪ agarose في الماء deionized وإضافة فورا 500 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر إلى كل بئر من لوحة 24 بئرا. اترك اللوحات على مقعد المختبر بين عشية وضحاها لتجفيف أي تكثيف. قبل 16 ساعة على الأقل من تغذية الدم، قم بإزالة أي مصدر للمياه أو السكر من البعوض الأنثوي.
في يوم التغذية ، سخني الدورة الدموية المائية إلى 37 درجة مئوية وأطعم البعوض بالدم الفقاري الموضوع في مغذيات اصطناعية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. ثم، نقل البعوض إلى طبق زجاجي على الجليد. حدد تلك التي هي محفورة بالدم ووضعها في وعاء مع الماء السكروز 30٪.
السماح على الأقل 72 ساعة للإناث لإنهاء إفراز وتطوير البيض. قبل حوالي ساعة واحدة من نقل البعوض إلى صفيحة 24 بئرا ، استخدم ماصة نقل لإضافة قطرتين إلى ثلاث قطرات من الماء في كل بئر. هدم البعوض بثاني أكسيد الكربون ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد.
ثم، ضع كل بعوضة بشكل فردي على غطاء مقلوب من لوحة 24 بئرا. بمجرد وضع جميع البعوض ال 24 ، قم بتغطية الغطاء بقاع لوحة مقلوبة ، وتأمينه بشريط مطاطي جديد جديد ووضعه في غرفة بيئية حتى يتعافى البعوض. ثم، بدوره لوحة الجانب الأيمن.
السماح للبعوض الإناث لoviposit لمدة 24 إلى 48 ساعة. ثم، وإزالة الإناث عن طريق الإفراج عنهم من لوحات في قفص كبير. قبل عد البيض، تحقق من كل بئر للبيض على جدران البئر وعلى هامش الآغاروز والسطح البلاستيكي حيث يصعب حلها في الصور الفوتوغرافية.
استخدام فرشاة الطلاء الرطب لنقل هذه البيض إلى سطح مستو بحيث يكون كل البيض في طائرة موحدة ولا تتداخل مع بعضها البعض. استخدم ملقط لإزالة أي كسر في الساقين والأجنحة والجسيمات الأخرى في الآبار التي قد تتداخل مع بيض التصوير. تعيين كاميرا رقمية مدمجة في وضع المجهر، والذي يسمح للمستخدم للتركيز على الكائنات أقرب سنتيمتر واحد واتخاذ صورة لكل بئر.
بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوح بأكمله. استخدم ملصق أمر التصوير لتمييز كل لوحة لاحقا. أضف حوالي خمس قطرات من الماء إلى كل بئر لمنع قابس الآغاروز والبيض من التجفيف والحث على نمو الجنين والفقس.
نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وإعادة تسمية الملفات مع لوحة و معرفات جيدا لتسهيل التنظيم. افتح الصور باستخدام ImageJ واستخدم أداة النقاط المتعددة لوضع علامة على كل بيضة، والتكبير أو التصغير لحساب كتل البيض. بعد وضع علامة على كل البيض، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز النقاط المتعددة لإحضار عدد العلامات وتسجيل النتائج في جدول بيانات.
ابدأ بإضافة الطعام إلى الآبار التي تحتوي على يرقات مفقسة بمجرد ظهورها. بعد ما يقرب من خمسة إلى ثمانية أيام ، تخدير اليرقات عن طريق تغطية الطبق بالجليد المسحوق لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أدخل مادة سوداء تحت اللوحة لتعزيز التباين وأخذ صور لكل بئر مع الحفاظ على الصفائح على الجليد.
بعد تصوير كل بئر، التقط صورة للوحة كاملة مع ملصق أمر التصوير. افتح الصور باستخدام ImageJ واستخدم أداة النقاط المتعددة لحساب اليرقات. يمكن أن تختلف اليرقات في الشكل والزاوية والتركيز.
استبعاد البشرة سقيفة، والتي تبدو وكأنها يرقات الرأس فقط مع القليل من الجسم، أو تقلصت اليرقات. تسجيل النتائج في جدول البيانات. تم حقن البعوض مع الحمض النووي الريبي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل تستهدف الناقل الحديد مرشح، FeT، أو جين التحكم، EGFP.
ثم، كانت تتغذى على الدم وقياسها لالخراز والخصوبة الناتج باستخدام طريقة لوحة النسر. وأظهر البعوض الذي تم إسكات تعبير ناقل الحديد فيه انخفاضا كبيرا في كل من عدد البيض ومعدل الفقس. كما أظهر البعوض الصامت FeT تأخر إفراز والبيض الصغيرة والخفيفة اللون.
التقاط صور جيدة هو خطوة حاسمة لهذه الطريقة لأن نوعية الصور وكمية البيض الفردية أو اليرقات تؤثر بشكل مباشر على نوعية النتائج.
