يود المؤلفون أن يشكروا مؤسسة التليف الكيسي التي قدمت التمويل لهذا البحث و MedImmune لتبرعهم السخي بالأجسام المضادة ل Psl0096. تم إجراء التصوير لهذه الدراسة في منشأة التصوير CAMiLoD في جامعة تورنتو.

مطلوب موافقة مجلس أخلاقيات البحث (REB) لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على الدراسات المقدمة هنا من قبل مستشفى الأطفال المرضى REB # 1000058579.
1. جمع البلغم
<ol><li>قم بتخزين البلغم البلغم في كوب تجميع معقم وخزنه على الفور في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة قبل التثبيت. ملاحظة: ترك البلغم لفترة طويلة جدا عند 4 درجات مئوية دون تثبيت يمكن أن يؤدي إلى تدهور الخلايا ، وخاصة تدهور خلايا الدم البيضاء. يفضل التثبيت في أسرع وقت ممكن.</li>
	<li>نقل عينات البلغم إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.</li>
	<li>أضف حجما مساويا من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى عينات البلغم. على سبيل المثال ، إذا كانت عينة البلغم 0.5 مل ، أضف 0.5 مل من 4٪ PFA. تخلط عن طريق انعكاس لطيف.</li>
	<li>احتضان البلغم طوال الليل عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>اغسل العينة بإضافة 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لكل 2 مل من البلغم الثابت. ملاحظة: لا يوجد طرد مركزي مطلوب لخطوة الغسيل هذه.</li>
	<li>إزالة بعناية طاف مع ماصة. ملاحظة: تجنب امتصاص البلغم مع الماصة عن طريق توجيه الطرف بعيدا عن البلغم ونضح السائل السطحي ببطء شديد. لا تتضمن خطوة الغسيل الطرد المركزي لعدم الإخلال بالسلامة الهيكلية لسدادات البلغم.</li>
	<li>كرر الخطوات 1.6-1.7 مرتين أخريين.</li>
	<li>أعد تعليق الحبيبات في 2x حجم PBS مع 0.01٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم.</li>
	<li>يخزن البلغم على حرارة 4 درجات مئوية.</li>
</ol>2. MiPACT (تقنية إزالة الأنسجة) معالجة البلغم
<ol><li>قم بإزالة مكونات الهيدروجيل (30٪ 29: 1 أكريلاميد: ثنائي أكريلاميد ، هاردنر ، و PBS) في حاوية محكمة الغلق تحتوي على عبوة لاهوائية قبل 72 ساعة. ملاحظة: العبوة اللاهوائية والحاوية المختومة ضرورية لأن الأكسجين يمنع بلمرة مادة الأكريلاميد. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة الأكسجين عن طريق تنفيذ هذه الخطوة في غطاء لاهوائي ، أو عن طريق وضع فراغ على حاوية مغلقة ، أو عن طريق فقاعات غاز N2 من خلال خليط الأكريلاميد.<ol><li>أضف 2 مل من 30٪ 29: 1 مادة الأكريلاميد: محلول ثنائي الأكريلاميد إلى أنبوب سعة 15 مل مع إزالة الغطاء داخل الحاوية اللاهوائية محكمة الغلق.</li>
		<li>اصنع مخزونا مركزا من 10٪ (وزن / حجم) مقوي بإضافة 0.5 جم من المقسى إلى 5 مل من PBS في أنبوب سعة 15 مل. اترك الغطاء بعيدا عن الأنبوب واحفظه في الحاوية اللاهوائية المغلقة.</li>
		<li>اترك بضعة مل من برنامج تلفزيوني معقم في أنبوب ، مع إزالة الغطاء ، داخل الحاوية اللاهوائية.</li>
	</ol></li>
	<li>اصنع محلول 5 مل من هيدروجيل بتركيز نهائي بنسبة 0.2٪ مقوي و 4٪ 29: 1 أكريلاميد: ثنائي أكريلاميد في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل. تخلط عن طريق الانقلاب وتصفية تعقيم.</li>
	<li>قم بإزالة عينات البلغم من الثلاجة ، ثم قطعها إلى أقسام صغيرة (قطرها حوالي 5 مم) تحت ظروف معقمة بمشرط. ملاحظة: إذا كان البلغم سائلا تماما ، فلا يزال من الممكن تنفيذ هذه الخطوة ، ومع ذلك ، فإن الأمر يتطلب المزيد من الصبر والممارسة لإزالة البلغم من محلول التخزين باستخدام الملقط قبل استخدام المشرط لفصل الكسور المطلوبة.</li>
	<li>ضع عينات البلغم المقطوعة داخل بئر من شريحة زجاجية ذات 8 غرف.</li>
	<li>أضف 300 ميكرولتر من محلول هيدروجيل معقم بالفلتر من الخطوة 2.2 إلى كل بئر من الآبار التي تحتوي على البلغم.</li>
	<li>ضع الغطاء الزجاجي المكون من 8 حجرات داخل وعاء مغلق يحتوي على عبوة لاهوائية لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: بمجرد بلمرة الهيدروجيل مع البلغم المضمن يجب أن يكون اتساق هلام صلب.</li>
	<li>انقل عينات البلغم الهيدروجيل المتصلب إلى أنبوب مزرعة سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من كبريتات دوديسيل الصوديوم 8٪ (SDS) ، ودرجة الحموضة 8 ، واسمح للعينات بالتنظيف لمدة 3-14 يوما عند 37 درجة مئوية (مع أو بدون اهتزاز) ، حتى يصبح البلغم شفافا. ملاحظة: تعتمد أوقات التطهير على تكوين البلغم ويمكن تقليلها بشكل عام مع الهز. ومع ذلك ، احرص على عدم زيادة سرعة الاهتزاز إلى درجة تعطيل سلامة العينة. تستغرق المزيد من العينات الغنية بالحمض النووي وقتا أطول للمسح مقارنة بالعينات الغنية بالمخاط.</li>
	<li>صب محلول SDS بنسبة 8٪ في حاوية لجمع النفايات. باستخدام ملاقط معقمة ، قم بنقل كل عينة مدمجة في هيدروجيل إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف 10 مل من PBS إلى كل من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل لغسل الهلاميات المائية واترك المحلول لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الصب. كرر هذا 2x مرات أكثر. ملاحظة: لا تتضمن خطوة الغسيل هذه الطرد المركزي. تتم إزالة السوائل الزائدة والمواد الطافية بعناية باستخدام ماصة.</li>
	<li>قم بتخزين العينات المغسولة في برنامج تلفزيوني مع 0.01٪ (وزن / حجم) أزيد الصوديوم ومثبط 1x RNase عند 4 درجات مئوية.</li>
</ol>3. بروتوكول التهجين الفلوري الهيدروجيل في الموقع (FISH)
<ol><li>قم بإزالة عينات الهيدروجيل من محلول التخزين الخاص بها باستخدام ملاقط معقمة وضع العينات على سطح معقم (مثل شريحة زجاجية أو طبق بتري).</li>
	<li>باستخدام مشرط معقم قطع الهلاميات المائية إلى شرائح ~ 1 مم.</li>
	<li>ضع أقسام 1 مم من هيدروجيل داخل أنابيب معقمة سعة 1.5 مل.</li>
	<li>تحضير 1 مل من المخزن المؤقت للتهجين (25٪ فورماميد ، 0.9 م كلوريد الصوديوم ، 20 مللي مول Tris-HCl [درجة الحموضة 7.6] ، 0.01٪ SDS ، منقى ومنزوع الأيونات H2O) في أنبوب 1.5 مل.</li>
	<li>أضف مسبار PseaerA المسمى بالفلورسنت (150.7 نانومتر12) إلى مخزن التهجين المؤقت واخلطه عن طريق الانقلاب. ملاحظة: يجب أن يبقى محلول الفورمالين بعيدا عن اللهب المكشوف. يمكن تحضير مخزن التهجين بشكل متقدم وتخزينه في قسامات عند -20 درجة مئوية13.</li>
	<li>أضف 200-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين إلى كل قسم ~ 1 مم من هيدروجيل وتأكد من غمر عينة الهيدروجيل بالكامل.</li>
	<li>اسمح لمسبار PseaerA بالتهجين مع عينات الهيدروجيل عن طريق وضعها في الظلام لمدة ~ 18-24 ساعة ، عند 46 درجة مئوية ، دون اهتزاز.</li>
	<li>صب المخزن المؤقت للتهجين في حاوية لجمع النفايات.</li>
	<li>اشطف العينات مرة واحدة باستخدام محلول الغسيل المعقم بالفلتر (337.5 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 20 مللي متر Tris-HCl ، 5 مللي متر EDTA (حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك) [pH 7.2] ، 0.01٪ SDS ، وتنقية وإزالة الأيوناتH 2O) عن طريق إضافة 1 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب من أنابيب 1.5 مل ثم إزالته. ملاحظة: يمكن عمل المخزن المؤقت للغسيل مسبقا وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>أضف 1 مل من محلول الغسيل الطازج إلى الأنابيب ، ثم احتضن العينات في الظلام لمدة 6 ساعات عند 48 درجة مئوية ، دون رج.</li>
</ol>4. هيدروجيل و Psl0096 ربط الأجسام المضادة
<ol><li>قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل بشكل معقم باستخدام ماصة سعة 1 مل.</li>
	<li>اشطف العينات باستخدام 2٪ BSA (w / v) في محلول PBS عن طريق إضافة وإزالة 1 مل من محلول 2٪ BSA.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من محلول 2٪ BSA / PBS إلى عينات الهيدروجيل لمنع ارتباط البروتين غير المحدد. ثم احتضان العينات بين عشية وضحاها ، في الظلام ، في RT ، دون اهتزاز.</li>
	<li>قم بإزالة محلول الحجب بشكل معقم باستخدام ماصة سعة 1 مل.</li>
	<li>قم بإعداد محلول الأجسام المضادة Psl0096-Texas Red عن طريق تخفيف الجسم المضاد إلى تركيز نهائي قدره 0.112 ميكروغرام / مل في 500 ميكرولتر من 2٪ BSA / PBS الطازجة.</li>
	<li>أضف محلول الأجسام المضادة 500 ميكرولتر إلى عينات هيدروجيل واحتضانها في RT لمدة 6 ساعات ، محمية من الضوء ، دون اهتزاز.</li>
</ol>5. دابي (4 ′ ، 6 ′-دياميدينو -2-فينيليندول) تلطيخ
<ol><li>قم بإعداد محلول مطابقة معامل الانكسار (RIMS) بإضافة 40 جم من وسط تدرج الكثافة غير الأيوني ، و 30 ميكرولتر من Tween20 ، و 3 ميكروغرام من أزيد الصوديوم ، و 30 مل من PBS إلى دورق يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي. حرك المحلول لمدة 15 دقيقة على محرك مغناطيسي ، أو حتى يذوب تماما.</li>
	<li>مرشح تعقيم الحل في أنبوب مخروطي 50 مل باستخدام حقنة 10 مل ومرشح معقم 0.2 ميكرومتر. ملاحظة: يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر.</li>
	<li>قم بإزالة محلول الأجسام المضادة Psl0096-Texas Red باستخدام ماصة معقمة سعة 1 مل.</li>
	<li>شطف عينات هيدروجيل عن طريق إضافة ثم إزالة 1 مل من برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>احتضان عينات الهيدروجيل ب 250 ميكرولتر من محلول RIMS و 10 ميكروغرام / مل من DAPI في RT مع اهتزاز لطيف ، في الظلام ، طوال الليل.</li>
	<li>قبل التصوير متحد البؤر ، قم بتركيب العينات على غرف نضح 0.9 مم أو 1.7 مم وأغلقها بغطاء زجاجي. ملاحظة: بعد FISH و / أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية وقبل الغمر في الحافات ، يمكن تطبيق بقع الليكتين الفلورية إذا كان تصور مخاط البلغم مطلوبا12.</li>
</ol>6. التصوير
<ol><li>قم بإجراء التصوير المجهري بالمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر باستخدام التقنيات القياسية بتكبير 25x أو 40x أو 63x أو 100x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis:+What+drug+and+which+way.">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li><li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis:+Pathophysiology,+diagnosis,+and+management.">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics.">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).</li><li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides,+alginate,+Pel,+and+Psl.">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li><li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding,+clearing,+and+rRNA+labeling.">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li><li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis.">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li><li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum:+Time+from+expectoration+to+processing.">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li><li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens:+An+immunocytochemical+analysis.">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li><li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients.">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li><li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erratum:+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis.">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).</li><li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples.">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li><li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis.">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity.">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).</li></ol>

الغرض من هذا البروتوكول هو السماح بإلقاء نظرة على التنظيم في الموقع لخلايا P. aeruginosa في البلغم من مرضى التليف الكيسي. يجب تخزين عينات البلغم عند 4 درجات مئوية حتى تتم معالجتها إذا تعذر إصلاحها على الفور. لقد ثبت أن أعداد خلايا P. aeruginosa في البلغم لا تتغير بشكل كبير إذا تمت معالجتها في 1...

في هذه الدراسة ، تم تصميم التجارب لتصور البنية في الجسم الحي ل Pseudomonas aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي للأطفال (CF). تصبح عدوى P. aeruginosa مزمنة في 30-40 ٪ من السكان المصابين بالتليف الكيسي لدى الأطفال. بمجرد أن تصبح العدوى المزمنة ثابتة ، يكاد يكون من المستحيل القضاء عليها1. تكون عزلات P. aeruginosa من المرضى الذين يعانون من العدوى المبكرة أكثر عرضة بشكل عام لمضادات الميكروبات ، وبالتالي ، يتم علاجها بالمضادات الحيوية المضادة للزائفة لمنع حدوث عدوى مزمنة2. لسوء الحظ ، لا يتم إزالة جميع عزلات P. aeruginosa بشكل فعال من الرئة بعد العلاج بالمضادات الحيوية. لم يتم توضيح الآليات الدقيقة المرتبطة بفشل المضادات الحيوية بشكل كامل. أظهرت الدراسات السابقة أن الاختلافات في كثافة خلايا الأغشية الحيوية والتجميع وإنتاج السكريات يمكن أن تؤثر على فعالية المضادات الحيوية3. تنتج P. aeruginosa ثلاثة سكريات خارج الخلية: Pel و Psl والجينات4. معظم سلالات P. aeruginosa لديها القدرة الوراثية للتعبير عن كل من عديدات السكاريد الخارجية ، على الرغم من أنه غالبا ما يتم التعبير عن نوع واحد من السكريات في الغالب5. يرتبط ألجينات السكاريد الخارجية بالتهابات مزمنة في رئة التليف الكيسي ، مما يؤدي إلى النمط الظاهري المخاطي 6,7. السكريات Pel و Psl لها وظائف متعددة بما في ذلك المساعدة في التعلق الأولي والحفاظ على بنية الأغشية الحيوية ، ومنح مقاومة المضادات الحيوية8.
تم تطوير طرق تهدف إلى تصور هياكل الأنسجة في الجسم الحي لمجموعة متنوعة من أنواع العينات9،10،11. في الآونة الأخيرة ، تم تصميمها لتصور المجتمعات الميكروبية في الجسم الحي داخل البلغم من مرضى التليف الكيسي12. تم تطوير تحسين بروتوكول إزالة الأنسجة خصيصا لتحديد المجتمعات الميكروبية داخل البلغم بواسطة DePas et al.، 201612. تمت صياغة مصطلح MiPACT ، الذي يرمز إلى microbial iتحديد بعد Passive CLARITY technique لإزالة البلغم CF11,12. بالنسبة لتقنيات إزالة الأنسجة ، يتم تثبيت العينات أولا ، ثم يتم جعلها شفافة مع ترك بنيتها المتأصلة سليمة للتلطيخ والتصور المجهري11. يسمح تثبيت عينات البلغم CF وإزالتها للباحثين بالإجابة على الأسئلة المتعلقة ببنية الأغشية الحيوية ، وكثافة الخلايا البكتيرية ، والارتباطات متعددة الميكروبات ، والارتباطات بين مسببات الأمراض والخلايا المضيفة. ميزة الفحص المباشر للبكتيريا التي تم الحفاظ عليها داخل البلغم هي أنه يمكن تحليلها وتصورها في سياق خاص بالمضيف. على الرغم من أن النمو في المختبر للعزلات السريرية في المختبر للتجربة يمكن أن يكون مفيدا للغاية ، إلا أن هذه الأساليب غير قادرة على إعادة إنشاء بيئة الرئة التليف الكيسي بالكامل ، مما يؤدي إلى انفصال بين نتائج المختبر ونتائج المرضى.
يمكن استخدام الطرق المعروضة هنا لإصلاح وإزالة البلغم لتصور البكتيريا ، سواء من مرضى التليف الكيسي أو المرضى الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي الأخرى. النوع المحدد من التلوين والتحليل المجهري الموصوف هنا هو التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، يليه ارتباط الأجسام المضادة ل PSL داخل الهيدروجيل ، والتحليل اللاحق عبر مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). بعد إزالة الأنسجة ، يمكن أيضا تطبيق طرق الكيمياء المناعية والفحص المجهري الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerogen2.5L</td>
			<td>Oxid Inc.</td>
			<td>35108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwell perfusion chambers</td>
			<td>Electron Microscopry Sciences</td>
			<td>70326 -12/-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoDenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Psl0096-Texas Red</td>
			<td>Medimmune</td>
			<td></td>
			<td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Hardener</td>
			<td>Wako</td>
			<td>27776-21-21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

يمكن أن يقلل الاكتشاف المبكر والقضاء على الزائفة الزنجارية داخل رئتي مرضى التليف الكيسي من فرصة الإصابة بعدوى مزمنة. يرتبط تطور عدوى P. aeruginosa المزمنة بانخفاض وظائف الرئة وزيادة المراضة. لذلك ، هناك اهتمام كبير بتوضيح أسباب الفشل في القضاء على P. aeruginosa بالعلاج بالمضادات الحيوية الذي يحدث في حوالي 10-40 ٪ من مرضى الأطفال. أحد العوامل العديدة التي يمكن أن تؤثر على تصفية العائل من المتصورة الزنجارية وقابلية المضادات الحيوية هو الاختلافات في التنظيم المكاني (مثل التجميع أو تكوين الأغشية الحيوية) وإنتاج السكريات. لذلك ، كنا مهتمين بتصور الخصائص الموضعية ل P. aeruginosa داخل بلغم مرضى التليف الكيسي. تم تطبيق تقنية إزالة الأنسجة على عينات البلغم بعد تضمين العينات في مصفوفة هيدروجيل للاحتفاظ بهياكل 3D بالنسبة للخلايا المضيفة. بعد إزالة الأنسجة ، تمت إضافة ملصقات الفلورسنت والأصباغ للسماح بالتصور. تم إجراء التهجين الفلوري في الموقع لتصور الخلايا البكتيرية ، وربط الأجسام المضادة المضادة ل PSL ذات العلامات الفلورية لتصور عديد السكاريد الخارجي وتلطيخ DAPI لتلطيخ الخلايا المضيفة للحصول على رؤية هيكلية. سمحت هذه الطرق بالتصوير عالي الدقة ل P. aeruginosa داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي عبر الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر.

يلخص الشكل 1 والشكل 2 التصميم العام للتجربة. يقدم الشكل 1 ملخصا لبروتوكولات معالجة البلغم وإزالة البلغم. قد تستغرق معالجة البلغم وإزالته ما يصل إلى 17 يوما. على الرغم من ذلك ، قد يتم إيقاف البروتوكول ، ويمكن تخزين العينات بعد التثبيت باستخدام P...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients at JoVE.com

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

يوفر هذا البروتوكول طرقا لتصور الخلايا البكتيرية ومجمع تخليق السكاريد (Psl) داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي.

تصور الزائفة الزنجارية داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

2.9K Views.  Hospital for Sick Children. يوفر هذا البروتوكول طرقا لتصور الخلايا البكتيرية ومجمع تخليق السكاريد (Psl) داخل البلغم لمرضى التليف الكيسي.

Video: Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

و إيل-8 عابر نموذج الماوس المعدلة وراثيا ل<em&gt; في فيفو</em&gt; رصد طويل الأمد للردود الالتهابية

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

نموذج التلقيح المتأخر لعدوى الجروح المزمنة الزائفة الجيروجينوسا

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...