Name: visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
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저자들은 이 연구에 자금을 지원한 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)과 항-Psl0096 항체를 아낌없이 기증한 MedImmune에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구를 위해 이미징은 토론토 대학의 CAMiLoD 이미징 시설에서 수행되었습니다.

연구 윤리 위원회(REB)의 승인은 인간 피험자로부터 객담 샘플을 수집하고 보관하는 데 필요합니다. 본 연구에 제시된 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.
1. 객담 채취
<ol><li>객담을 멸균 채취 컵에 보관하고 즉시 4°C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 고정합니다. 알림: 가래를 고정하지 않고 4°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분해, 특히 백혈구 분해가 발생할 수 있습니다. 가능한 한 빨리 고정하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>객담 검체를 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>객담 샘플에 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 예를 들어, 객담 샘플이 0.5mL인 경우 0.5mL의 4% PFA를 추가합니다. 부드러운 반전으로 섞는다.</li>
	<li>4 °C에서 밤새 가래를 배양합니다.</li>
	<li>고정 객담 2mL 각각에 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 샘플을 세척합니다. 알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 알림: 팁을 가래에서 멀어지게 하여 피펫으로 가래를 빨아들이지 말고 표면 액체에서 매우 천천히 흡인하십시오. 세척 단계에는 가래 플러그의 구조적 무결성을 방해하지 않도록 원심 분리가 포함되지 않습니다.</li>
	<li>1.6-1.7단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>펠릿을 PBS 부피의 2배에 0.01%(w/v) 아지드화나트륨으로 재현탁시킵니다.</li>
	<li>객담은 4 °C에서 보관한다.</li>
</ol>2. 객담의 MiPACT(조직 청소 기술) 처리
<ol><li>하이드로겔 성분(30% 29:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드, 경화제 및 PBS)을 혐기성 팩이 들어 있는 밀봉된 용기에서 72시간 전에 가스를 제거합니다. 알림: 산소가 아크릴아마이드 중합을 억제하기 때문에 혐기성 팩과 밀봉된 용기가 필요합니다. 대안적으로, 산소는 혐기성 후드 내에서 이 단계를 수행하거나, 밀봉된 용기에 진공을 적용하거나, 아크릴아마이드 혼합물을 통해N2 가스를 버블링함으로써 제거될 수 있다.<ol><li>밀봉된 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태에서 30% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드 용액 2mL를 15mL 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>15mL 튜브에 PBS 5mL에 경화제 0.5g을 첨가하여 10%(w/v) 경화제의 농축액을 만듭니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 밀봉된 혐기성 용기에 보관하십시오.</li>
		<li>멸균 PBS 몇 mL를 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태로 튜브에 그대로 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>15mL 튜브에 PBS의 0.2% 경화제와 4% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드의 최종 농도로 하이드로겔 용액 5mL를 만듭니다. 반전으로 혼합하고 필터 살균합니다.</li>
	<li>냉장고에서 가래 샘플을 꺼낸 다음 메스로 멸균 상태에서 작은 부분(직경 약 5mm)으로 자릅니다. 알림: 가래가 매우 유동적인 경우에도 이 단계를 수행할 수 있지만 메스를 사용하여 원하는 분획을 분리하기 전에 핀셋으로 보관 용액에서 가래를 제거하려면 더 많은 인내심과 연습이 필요합니다.</li>
	<li>절단된 객담 샘플을 8개의 챔버가 있는 커버글라스 슬라이드의 우물 안에 넣습니다.</li>
	<li>300단계에서 필터 멸균 하이드로겔 용액 2.2μL를 객담이 포함된 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>혐기성 팩이 들어 있는 밀폐된 용기 안에 8개의 챔버 커버글라스를 37°C에서 3시간 동안 보관합니다. 알림: 일단 중합되면 가래가 내장된 하이드로겔은 단단한 겔의 농도여야 합니다.</li>
	<li>응고된 하이드로겔 객담 샘플을 pH 8의 8% 도데실 황산나트륨(SDS) 5mL가 들어 있는 15mL 배양 튜브로 옮기고 가래가 투명해질 때까지 37°C(흔들림 유무에 관계없이)에서 3-14일 동안 샘플을 투명하게 둡니다. 알림: 청소 시간은 객담 성분에 따라 다르며 일반적으로 흔들면 줄일 수 있습니다. 그러나 샘플 무결성을 방해할 정도로 진탕 속도를 높이지 않도록 주의하십시오. DNA가 풍부한 샘플은 점액이 풍부한 샘플에 비해 투명화하는 데 더 오래 걸립니다.</li>
	<li>8% SDS 용액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 하이드로겔 포매 샘플을 멸균 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 50mL 코니컬 튜브 각각에 PBS 10mL를 추가하여 하이드로겔을 세척하고 용액을 30분에서 1시간 동안 그대로 두었다가 디캔팅합니다. 이것을 2배 더 반복하십시오. 알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 포함되지 않습니다. 과도한 체액과 상층액은 피펫으로 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>세척된 시료를 0.01%(w/v)의 아지드화나트륨 및 1x RNase 억제제와 함께 4°C에서 PBS에 보관합니다.</li>
</ol>3. 하이드로겔 형광 in situ hybridization (FISH) 프로토콜
<ol><li>멸균 핀셋을 사용하여 보관 용액에서 하이드로겔 샘플을 제거하고 멸균 표면(예: 유리 슬라이드 또는 페트리 접시)에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>멸균 메스를 사용하여 하이드로겔을 ~ 1mm 두께로 자릅니다.</li>
	<li>하이드로겔 1mm 절편을 멸균 1.5mL 튜브 안에 넣습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 1 mL 혼성 완충액 (25 % 포름 아미드, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01 % SDS, 정제 및 탈 이온화 H2O)을 준비합니다.</li>
	<li>형광 표지된 PseaerA 프로브(150.7nM12)를 혼성화 버퍼에 추가하고 반전으로 혼합합니다. 알림: 포르말린 용액은 화염에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. 혼성화 완충액은 고급으로 제조될 수 있고, -20°C에서 부분 표본으로 저장될 수있다 13.</li>
	<li>하이드로겔의 각 ~1mm 섹션에 200-500μL의 혼성화 완충액을 추가하고 하이드로겔 샘플 전체가 잠기도록 합니다.</li>
	<li>PseaerA 프로브가 흔들리지 않고 46°C에서 ~ 18-24시간 동안 어둠 속에 두어 하이드로겔 샘플과 하이브리드화되도록 합니다.</li>
	<li>혼성화 완충액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다.</li>
	<li>필터 멸균 세척 완충액 (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) [pH 7.2], 0.01 % SDS)로 샘플을 한 번 헹구고 1.5 mL 튜브 각각에 세척 완충액 1mL를 첨가하여 정제 및 탈 이온화 된 H2O)를 제거한 다음 제거합니다. 알림: 세척 버퍼는 미리 만들어 실온(RT)에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>1mL의 신선한 세척 완충액을 튜브에 넣은 다음 어두운 곳에서 48°C에서 6시간 동안 흔들지 않고 샘플을 배양합니다.</li>
</ol>4. 하이드로겔 및 Psl0096 항체 결합
<ol><li>1mL 피펫터를 사용하여 세척 버퍼를 멸균 상태로 제거합니다.</li>
	<li>2% BSA 용액 1mL를 추가 및 제거하여 PBS 용액에서 2% BSA(w/v)로 샘플을 헹굽니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플에 2% BSA/PBS 용액 500μL를 첨가하여 비특이적 단백질 결합을 차단합니다. 그런 다음 샘플을 밤새 어두운 곳에서, 흔들지 않고 RT에서 배양합니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 차단 용액을 멸균 제거합니다.</li>
	<li>항체를 500μL의 신선한 2% BSA/PBS에 최종 농도 0.112μg/mL로 희석하여 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플에 500μL 항체 용액을 추가하고 흔들리지 않고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 6시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole) 염색
<ol><li>자기 교반 막대가 들어 있는 플라스크에 비이온 밀도 그래디언트 배지 40g, Tween20 30μL, 아지드화나트륨 3μg, PBS 30mL를 첨가하여 굴절률 매칭 용액(RIMS)을 준비합니다. 용액을 자석 교반기에서 15분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.</li>
	<li>10mL 주사기와 멸균 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 50mL 원뿔형 튜브로 필터 멸균합니다. 참고: 용액은 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 1mL 피펫으로 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 제거합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플을 헹구고 PBS 1mL를 추가한 다음 제거합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플을 250μL의 RIMS 용액과 10μg/mL의 DAPI로 RT에서 어둠 속에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.</li>
	<li>컨포칼 이미징 전에 샘플을 0.9mm 또는 1.7mm 관류 챔버에 장착하고 유리 커버슬립으로 밀봉합니다. 참고: FISH 및/또는 면역조직화학 검사 후 RIMS에 담그기 전, 객담 점액의 시각화가 필요한 경우 형광 렉틴 염색을 적용할 수 있다12.</li>
</ol>6. 이미징
<ol><li>표준 기술을 사용하여 25x, 40x, 63x 또는 100x 배율에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol>
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이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수...

이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다1. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다2. 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다3. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다4. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다5. 엑소다당류 알긴산은 CF 폐의 만성 감염과 관련이 있으며, 점액성 표현형 6,7을 초래합니다. 다당류 Pel과 Psl은 초기 부착 및 생물막 구조 유지를 돕고 항생제 내성을 부여하는 등 여러 기능을 가지고 있습니다8.
조직의 생체 내 구조를 시각화하는 것을 목표로 하는 방법은 다양한 샘플 유형 9,10,11에 대해 개발되었습니다. 최근에는 CF 환자의 객담 내 생체 내 미생물 군집을 시각화하도록 맞춤화되었습니다12. 객담 내 미생물 군집 식별을 위한 조직 투명화 프로토콜의 최적화는 DePas et al., 201612에 의해 개발되었습니다. Pa ssive CLARITY technique 이후 microbial identification의 약자인 MiPACT라는 용어는 CF 가래11,12의 제거를 위해 만들어졌습니다. 조직 투명화 기법의 경우, 표본을 먼저 고정한 다음 투명하게 렌더링하면서 염색 및 현미경 시각화를 위해 고유한 구조를 그대로 유지합니다11. CF 객담 샘플을 고정하고 투명화하면 생물막 구조, 박테리아 세포 밀도, 다균 결합, 병원체와 숙주 세포 간의 연관성과 관련된 질문에 답할 수 있습니다. 객담 내에 보존된 박테리아를 직접 검사하는 것의 장점은 숙주별 맥락에서 분석하고 시각화할 수 있다는 것입니다. 실험을 위해 실험실에서 임상 분리체의 체외 성장은 매우 유익할 수 있지만, 이러한 방법은 CF 폐 환경을 완전히 재현할 수 없으므로 실험실 결과와 환자 결과 사이에 단절이 발생합니다.
여기에 제시된 방법은 CF 환자나 다른 호흡기 감염 환자의 박테리아를 시각화하기 위해 객담을 고정하고 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 염색 및 현미경 분석의 특정 유형은 형광 in situ hybridization(FISH), 하이드로겔 내 항-PSL 항체 결합, 그리고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통한 후속 분석이다. 조직 투명화 후 다른 면역조직화학 및 현미경 검사법도 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfusion chambers</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td></tr><tr><td>VA-044 Hardener</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.

실험의 전체 설계는 그림 1 과 그림 2에 요약되어 있습니다. 그림 1 은 객담 처리 및 객담 제거 프로토콜에 대한 요약을 제공합니다. 객담 처리 및 청소에는 최대 17일이 소요될 수 있습니다. 그러나 프로토콜은 중단될 수 있으며 샘플은 PFA 고정 후(2일) 또는 조직 투명화 후(투명 시간에 따라 5-17일) 보관할 수 있습니다. <strong class="xf...

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Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

3.0K 조회수.  Hospital for Sick Children. 이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

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Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

연구

면역학 및 감염병학

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

<meta charset="utf8"></head><body>항균 검사 및 미생물 역학 분석을 위한 적응형 CF 모델

Development of a Polymicrobial Colony Biofilm Model to Test Antimicrobials in Cystic Fibrosis

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as colony-forming units or metabolic activity. Furthermore, many biofilm models do not reflect the biological and physiochemical properties of the human host environment. This is an important issue in many conditions, but most noticeably in cystic fibrosis (CF). A large proportion of people with CF suffer from both chronic and intermittent infections, and in vitro, antibiotic susceptibility testing poorly correlates with patient treatment outcomes. Some biofilm models incorporate CF lung-relevant media, including synthetic sputum mimics, but do not consider the polymicrobial nature of the environment, which alters biofilm architecture, physiology, and the way microbes respond to treatment. The solid-air interface colony biofilm model described here is highly adaptable and incorporates both CF-relevant media and a polymicrobial context. This model can also be used for mid-throughput screening of antimicrobials and to study their effect on polymicrobial dynamics. Output measurements from the model can be colony-forming units, metabolic activity, and confocal microscopy analysis. The model can easily be adapted to different microorganisms, media, temperatures, and variable oxygen conditions and can be used to test a wide range of chemical, biological, and physical treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

This methodology allows for the establishment of a polymicrobial biofilm model in cystic fibrosis for antimicrobial sensitivity testing in research and clinical laboratories. This model provides accurate and reliable results over a range of outputs.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

A range of bacteria biofilm models exist for the testing of antibiotics. However, many of these are limited to a single experimental output, such as ...

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

요약

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위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용

장기 만성

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발