Yazarlar, bu araştırma için fon sağlayan Kistik Fibrozis Vakfı'na ve cömert anti-Psl0096 antikor bağışları için MedImmuno'ya teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma için görüntüleme, Toronto Üniversitesi'ndeki CAMiLoD görüntüleme tesisinde gerçekleştirildi.

İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve saklanması için Araştırma Etik Kurulu (REB) onayı gereklidir. Burada sunulan çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.
1. Balgam Toplama
<ol><li>Balgam söktürücü balgamı steril bir toplama kabında saklayın ve fiksasyondan hemen önce en fazla 24 saat 4 °C'de saklayın. NOT: Balgamı fiksasyon olmadan 4 ° C'de çok uzun süre bırakmak, hücresel bozulmaya, özellikle beyaz kan hücrelerinin bozulmasına neden olabilir. Mümkün olan en kısa sürede sabitleme tercih edilir.</li>
	<li>Balgam örneklerini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Balgam örneklerine eşit hacimde %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin. Örneğin, balgam örneği 0.5 mL ise, 0.5 mL %4 PFA ekleyin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.</li>
	<li>Balgamı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>Her 2 mL sabit balgama 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek numuneyi yıkayın. NOT: Bu yıkama adımı için santrifüj gerekmez.</li>
	<li>Süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın. NOT: Ucu balgamdan uzağa doğrultarak balgamı pipetle emmekten kaçının ve yüzeydeki sıvıyı çok yavaş bir şekilde aspire edin. Yıkama adımı, balgam tıkaçlarının yapısal bütünlüğünü bozmamak için santrifüj içermez.</li>
	<li>1.6-1.7 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Pelet, %0,01 (a/h) sodyum azid ile PBS hacminin 2 katı kadar yeniden süspanse edilir.</li>
	<li>Balgamı 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Balgamın MiPACT (doku temizleme tekniği) işlenmesi
<ol><li>Hidrojel bileşenlerini (%30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid, sertleştirici ve PBS) 72 saat önce anaerobik bir paket içeren kapalı bir kapta gazdan arındırın. NOT: Anaerobik paket ve kapalı kap gereklidir çünkü oksijen akrilamid polimerizasyonunu inhibe eder. Alternatif olarak, bu adım anaerobik bir başlıkta gerçekleştirilerek, kapalı bir kaba vakum uygulanarak veyaN2 gazının akrilamid karışımından köpürtülmesiyle oksijen çıkarılabilir.<ol><li>Kapalı anaerobik kabın içinde kapağı kapalı olacak şekilde 15 mL'lik bir tüpe 2 mL %30 29:1 akrilamid: bis-akrilamid çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>15 mL'lik bir tüpte 5 mL PBS'ye 0,5 g sertleştirici ekleyerek konsantre bir %10 (a/h) sertleştirici stoğu yapın. Kapağı tüpün dışında bırakın ve kapalı anaerobik kapta saklayın.</li>
		<li>Anaerobik kabın içinde, kapağı kapalı olarak bir tüpte birkaç mL steril PBS bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>15 mL'lik bir tüpte PBS'de nihai konsantrasyonu %0.2 sertleştirici ve %4 29:1 akrilamid olan 5 mL hidrojel çözeltisi yapın. Ters çevirerek karıştırın ve filtre sterilize edin.</li>
	<li>Balgam örneklerini buzdolabından çıkarın, ardından steril koşullar altında bir neşter ile küçük bölümler halinde (kabaca 5 mm çapında) kesin. NOT: Balgam oldukça akışkansa, bu adım yine de gerçekleştirilebilir, ancak istenen fraksiyonları ayırmak için neşteri kullanmadan önce balgamı cımbızla saklama solüsyonundan çıkarmak daha fazla sabır ve pratik gerektirir.</li>
	<li>Kesilen balgam örneklerini 8 odacıklı bir kapak camı slaytının kuyusuna yerleştirin.</li>
	<li>Balgam içeren kuyucukların her birine adım 2.2'den 300 μL filtre sterilize hidrojel çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>8 odacıklı kapak camını anaerobik paket içeren kapalı bir kabın içine 37 °C'de 3 saat yerleştirin. NOT: Gömülü balgam ile hidrojel polimerize edildikten sonra sert jel kıvamında olmalıdır.</li>
	<li>Katılaşmış hidrojel balgam numunelerini 5 mL %8 sodyum dodesil sülfat (SDS), pH 8 içeren 15 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın ve numunelerin 37 °C'de (çalkalayarak veya çalkalanmadan) 3-14 gün boyunca balgam şeffaf hale gelene kadar temizlenmesine izin verin. NOT: Temizleme süreleri balgam bileşimine bağlıdır ve genellikle çalkalama ile azaltılabilir. Ancak çalkalama hızını numune bütünlüğünü bozacak kadar artırmamaya özen gösterin. DNA açısından zengin örneklerin temizlenmesi, mukus açısından zengin örneklere kıyasla daha uzun sürer.</li>
	<li>%8 SDS çözeltisini bir atık toplama kabına boşaltın. Steril cımbız kullanarak, hidrojel gömülü her numuneyi steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hidrojelleri yıkamak için 50 mL'lik konik tüplerin her birine 10 mL PBS ekleyin ve çözeltiyi boşaltmadan önce 30 dakika ila 1 saat bekletin. Bunu 2 kat daha tekrarlayın. NOT: Bu yıkama adımı santrifüj içermez. Fazla sıvı ve süpernatant bir pipetle dikkatlice çıkarılır.</li>
	<li>Yıkanmış numuneleri 4 °C'de %0,01 (a/h) sodyum azid ve 1x RNaz inhibitörü ile PBS'de saklayın.</li>
</ol>3. Hidrojel floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokolü
<ol><li>Hidrojel numunelerini steril cımbız kullanarak saklama solüsyonlarından çıkarın ve numuneleri steril bir yüzeye (cam slayt veya Petri kabı gibi) yerleştirin.</li>
	<li>Steril bir neşter kullanarak hidrojelleri ~ 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesin.</li>
	<li>Hidrojelin 1 mm'lik bölümlerini steril 1,5 mL'lik tüplerin içine yerleştirin.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir tüpte 1 mL hibridizasyon tamponu (%25 formamid, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], %0.01 SDS, saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) hazırlayın.</li>
	<li>Floresan etiketli PseaerA probunu (150.7 nM12) hibridizasyon tamponuna ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. NOT: Formalin çözeltisi açık alevden uzak tutulmalıdır. Hibridizasyon tamponu önceden hazırlanabilir ve -20 ° C'de alikotlarda saklanabilir13.</li>
	<li>Hidrojelin her ~1 mm'lik bölümüne 200-500 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hidrojel numunesinin tamamının suya daldırıldığından emin olun.</li>
	<li>PseaerA probunun hidrojel numunelerini ~ 18-24 saat, 46 °C'de çalkalamadan karanlıkta bırakarak hibridize olmasına izin verin.</li>
	<li>Hibridizasyon tamponunu bir atık toplama kabına boşaltın.</li>
	<li>1,5 mL'lik tüplerin her birine 1 mL yıkama tamponu ekleyerek numuneleri filtreyle sterilize edilmiş yıkama tamponu (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) [pH 7,2], %0,01 SDS ve saflaştırılmış ve deiyonizeH2O) ile bir kez durulayın ve ardından çıkarın. NOT: Yıkama tamponu önceden yapılabilir ve oda sıcaklığında (RT) saklanabilir.</li>
	<li>Tüplere 1 mL taze yıkama tamponu ekleyin, ardından numuneleri karanlıkta 48 °C'de 6 saat çalkalamadan inkübe edin.</li>
</ol>4. Hidrojel ve Psl0096 antikor bağlanması
<ol><li>Yıkama tamponunu 1 mL'lik bir pipetleyici kullanarak steril olarak çıkarın.</li>
	<li>%2 BSA çözeltisinden 1 mL ekleyip çıkararak numuneleri PBS çözeltisinde %2 BSA (a/h) ile durulayın.</li>
	<li>Spesifik olmayan protein bağlanmasını bloke etmek için hidrojel numunelerine 500 μL %2 BSA/PBS çözeltisi ekleyin. Daha sonra numuneleri gece boyunca, karanlıkta, RT'de çalkalamadan inkübe edin.</li>
	<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak bloke edici solüsyonu steril olarak çıkarın.</li>
	<li>Antikoru 500 μL taze %2 BSA/PBS içinde 0.112 μg/mL'lik nihai konsantrasyona seyrelterek Psl0096-Texas Red antikor çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>500 μL'lik antikor çözeltisini hidrojel örneklerine ekleyin ve bunları RT'de 6 saat boyunca ışıktan korunarak, çalkalamadan inkübe edin.</li>
</ol>5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol) boyama
<ol><li>Manyetik karıştırma çubuğu içeren bir şişeye 40 g iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı, 30 μL Tween20, 3 μg sodyum azid ve 30 mL PBS ekleyerek kırılma indisi eşleştirme çözeltisini (RIMS) hazırlayın. Çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde 15 dakika veya tamamen eriyene kadar karıştırın.</li>
	<li>Filtre, 10 mL'lik bir şırınga ve steril 0.2 μm'lik bir filtre kullanarak çözeltiyi 50 mL'lik bir konik tüpe sterilize eder. NOT: Çözelti 4 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
	<li>Psl0096-Texas Red antikor solüsyonunu steril 1 mL'lik bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Hidrojel örneklerini 1 mL PBS ekleyip çıkararak durulayın.</li>
	<li>Hidrojel numunelerini 250 μL RIMS çözeltisi ve 10 μg/mL DAPI ile RT'de gece boyunca karanlıkta hafifçe çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Konfokal görüntülemeden önce, numuneleri 0,9 mm veya 1,7 mm perfüzyon odalarına monte edin ve bir cam lamel ile kapatın. NOT: FISH ve/veya immünohistokimyadan sonra ve RIMS'e daldırılmadan önce, balgam mukozasının görüntülenmesi isteniyorsa floresan lektin boyaları uygulanabilir12.</li>
</ol>6. Görüntüleme
<ol><li>25x, 40x, 63x veya 100x büyütmelerde standart teknikleri kullanarak konfokal lazer tarama mikroskobu görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis:+What+drug+and+which+way.">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li><li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis:+Pathophysiology,+diagnosis,+and+management.">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics.">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).</li><li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides,+alginate,+Pel,+and+Psl.">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li><li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding,+clearing,+and+rRNA+labeling.">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li><li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis.">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li><li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+sputum:+Time+from+expectoration+to+processing.">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li><li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens:+An+immunocytochemical+analysis.">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li><li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients.">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li><li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erratum:+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis.">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).</li><li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples.">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li><li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis.">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity.">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).</li></ol>

Bu protokolün amacı, KF hastalarından balgamda P. aeruginosa hücrelerinin in-situ organizasyonuna bir bakış sağlamaktır. Balgam örnekleri, hemen sabitlenemiyorlarsa işlenene kadar 4 °C'de saklanmalıdır. Balgamdaki P. aeruginosa hücre sayılarının, 4 °C'de saklandığında 1 saat, 24 saat veya 48 saatte işlenirse önemli ölçüde değişmediği, ancak 24 veya 48 saat boyunca 25 °C'de bırakılırsa, bakteri büyümesinin bir sonucu olarak bakteri hücre sayılarının önemli ölçüd...

Bu çalışmada, pediatrik kistik fibrozis (KF) hastalarının balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın in vivo yapısını görselleştirmek için deneyler tasarlanmıştır. P. aeruginosa enfeksiyonları pediatrik KF popülasyonunun% 30-40'ında kronikleşir; Kronik enfeksiyonlar bir kez yerleştikten sonra, ortadan kaldırılması neredeyse imkansızdır1. Erken enfeksiyonu olan hastalardan P. aeruginosa izolatları genellikle antimikrobiyallere daha duyarlıdır, bu nedenle bunlar kronik enfeksiyonun oluşmasını önlemek için anti-psödomonal antibiyotiklerle tedavi edilir2. Ne yazık ki, tüm P. aeruginosa izolatları antibiyotik tedavisini takiben akciğerden etkili bir şekilde temizlenmez. Antibiyotik yetmezliği ile ilişkili kesin mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır. Önceki çalışmalar, biyofilm hücre yoğunluğu, agregasyonu ve polisakkarit üretimindeki değişikliklerin antibiyotik etkinliğini etkileyebileceğini göstermiştir3. P. aeruginosa üç hücre dışı polisakkarit üretir: Pel, Psl ve aljinat4. P. aeruginosa'nın çoğu suşu, ekzopolisakkaritlerin her birini eksprese etmek için genetik kapasiteye sahiptir, ancak genellikle bir tür polisakkarit ağırlıklı olarak5 eksprese edilir. Ekzopolisakkarit aljinat, KF akciğerindeki kronik enfeksiyonlarla ilişkilidir ve bu da mukoid fenotip 6,7 ile sonuçlanır. Polisakkaritler Pel ve Psl, ilk bağlanmaya ve biyofilm yapısının korunmasına yardımcı olmak ve antibiyotik direnci kazandırmak dahil olmak üzere birçok işleve sahiptir8.
Dokuların in vivo yapılarını görselleştirmeyi amaçlayan yöntemler, çeşitli numune tipleri için geliştirilmiştir 9,10,11. Daha yakın zamanlarda, KF hastalarından balgam içindeki in vivo mikrobiyal toplulukları görselleştirmek için uyarlanmışlardır12. Özellikle balgam içindeki mikrobiyal toplulukların tanımlanması için bir doku temizleme protokolünün optimizasyonu DePas ve ark., 201612 tarafından geliştirilmiştir. Passive CLARITY technique'den sonra microbial iidentification anlamına gelen MiPACT terimi, CF balgam11,12'nin temizlenmesi için icat edildi. Doku temizleme teknikleri için, örnekler önce sabitlenir, daha sonra boyama ve mikroskobik görselleştirme için doğal mimarileri bozulmadan bırakılırken şeffaf hale getirilir11. KF balgam örneklerinin sabitlenmesi ve temizlenmesi, araştırmacıların biyofilm yapısı, bakteriyel hücre yoğunluğu, polimikrobiyal ilişkiler ve patojenler ile konakçı hücreler arasındaki ilişkiler ile ilgili soruları yanıtlamasına olanak tanır. Balgam içinde korunmuş bakterileri doğrudan incelemenin avantajı, konakçıya özgü bir bağlamda analiz edilebilmeleri ve görselleştirilebilmeleridir. Deney için laboratuvarda klinik izolatların in vitro büyümesi çok bilgilendirici olabilse de, bu tür yöntemler KF akciğer ortamını tam olarak yeniden oluşturamaz ve bu da laboratuvar sonuçları ile hasta sonuçları arasında bir kopukluğa neden olur.
Burada sunulan yöntemler, KF hastalarından veya diğer solunum yolu enfeksiyonları olan hastalardan bakterileri görselleştirmek için balgamı sabitlemek ve temizlemek için kullanılabilir. Burada tarif edilen spesifik boyama ve mikroskobik analiz türü, floresan in situ hibridizasyon (FISH), ardından hidrojel içinde anti-Psl-antikor bağlanması ve ardından konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yoluyla analizdir. Doku temizliğini takiben diğer immünohistokimya ve mikroskopi yöntemleri de uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerogen2.5L</td>
			<td>Oxid Inc.</td>
			<td>35108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwell perfusion chambers</td>
			<td>Electron Microscopry Sciences</td>
			<td>70326 -12/-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoDenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Psl0096-Texas Red</td>
			<td>Medimmune</td>
			<td></td>
			<td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Hardener</td>
			<td>Wako</td>
			<td>27776-21-21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

Kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde Pseudomonas aeruginosa'nın erken tespiti ve eradikasyonu, kronik enfeksiyon gelişme şansını azaltabilir. Kronik P. aeruginosa enfeksiyonlarının gelişimi, akciğer fonksiyonlarında azalma ve artmış morbidite ile ilişkilidir. Bu nedenle, pediatrik hastaların yaklaşık %10-40'ında görülen antibiyotik tedavisi ile P. aeruginosa'nın eradike edilememesinin nedenlerinin aydınlatılmasına büyük ilgi vardır. P. aeruginosa'nın konakçı klirensini ve antibiyotik duyarlılığını etkileyebilecek birçok faktörden biri, mekansal organizasyondaki (agregasyon veya biyofilm oluşumu gibi) ve polisakkarit üretimindeki farklılıklardır. Bu nedenle, KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın in situ özelliklerini görselleştirmek istedik. Balgam örneklerine, konakçı hücrelere göre 3 boyutlu yapıları korumak için örnekleri bir hidrojel matrisine gömdükten sonra bir doku temizleme tekniği uygulandı. Doku temizlendikten sonra, görselleştirmeye izin vermek için floresan etiketler ve boyalar eklendi. Bakteri hücrelerinin görselleştirilmesi için floresan in situ hibridizasyon, ekzopolisakkaritin görselleştirilmesi için floresan etiketli anti-Psl-antikorlarının bağlanması ve yapısal içgörü elde etmek için konakçı hücreleri boyamak için DAPI boyama gerçekleştirildi. Bu yöntemler, konfokal lazer tarama mikroskobu ile KF hastalarının balgamında P. aeruginosa'nın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verdi.

Deneyin genel tasarımı Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Şekil 1 , balgam işleme ve balgam temizleme protokollerinin bir özetini sağlar. Balgam işleme ve temizleme 17 güne kadar sürebilir. Bununla birlikte, protokol durdurulabilir ve numuneler PFA ile fiksasyondan sonra (2. gün) veya doku temizliğinden sonra (temizleme süresine bağlı olarak 5-17. günler) saklanabilir. Şekil 2'de F...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients at JoVE.com

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.

Kistik Fibrozis Hastalarının Balgamında Pseudomonas aeruginosa'nın Görüntülenmesi

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

2.9K Görüntüleme.  Hospital for Sick Children. Bu protokol, kistik fibrozis hastalarının balgamındaki bakteri hücrelerinin ve polisakkarit sentez lokusu (Psl) polisakkaritinin görüntülenmesi için yöntemler sağlar.

Video: Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Sipariş edilmiş, Pseudomonas aeruginosa baskı PA14 Transposon ekleme mutantlar Nonredundant Kütüphane çoğaltılması

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Pseudomonas aeruginosa Küçük Koloni Varyant Kültürü ve Aljinat Quantitation

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Kronik Pseudomonas aeruginosa Yara Enfeksiyonu Gecikmiş Aşılama Modeli

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...