Gli autori desiderano ringraziare la Cystic Fibrosis Foundation che ha finanziato questa ricerca e MedImmune per la loro generosa donazione di anticorpi anti-Psl0096. Per questo studio l'imaging è stato eseguito presso la struttura di imaging CAMiLoD dell'Università di Toronto.

Per raccogliere e conservare campioni di espettorato da soggetti umani è necessaria l'approvazione del Research Ethics Board (REB). Gli studi qui presentati sono stati approvati dall'Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Raccolta dell'espettorato
<ol><li>Conservare l'espettorato espettorato in una coppetta sterile e conservare immediatamente a 4 °C per un massimo di 24 ore prima della fissazione. NOTA: Lasciare l'espettorato troppo a lungo a 4 °C senza fissazione può portare alla degradazione cellulare, in particolare alla degradazione dei globuli bianchi. È preferibile fissarlo il prima possibile.</li>
	<li>Trasferire i campioni di espettorato in una provetta sterile da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di paraformaldeide (PFA) al 4% ai campioni di espettorato. Ad esempio, se il campione di espettorato è di 0,5 mL, aggiungere 0,5 mL di PFA al 4%. Mescolare con leggera inversione.</li>
	<li>Incubare l'espettorato per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare il campione aggiungendo 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a ogni 2 mL di espettorato fisso. NOTA: Non è necessaria alcuna centrifugazione per questa fase di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta. NOTA: Evitare di aspirare l'espettorato con la pipetta puntando la punta lontano dall'espettorato e aspirare molto lentamente il liquido superficiale. La fase di lavaggio non prevede centrifugazione per non disturbare l'integrità strutturale dei tappi di espettorato.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.6-1.7 altre due volte.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 2 volte il volume del PBS con lo 0,01 % (p/v) di sodio azide.</li>
	<li>Conservare l'espettorato a 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (tecnica di pulizia dei tessuti) trattamento dell'espettorato
<ol><li>Degassare i componenti dell'idrogel (30% acrilammide 29:1: bis-acrilammide, indurente e PBS) in un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico prima per 72 ore. NOTA: Il pacchetto anaerobico e il contenitore sigillato sono necessari perché l'ossigeno inibisce la polimerizzazione dell'acrilammide. In alternativa, l'ossigeno può essere rimosso eseguendo questo passaggio in una cappa anaerobica, applicando un vuoto a un contenitore sigillato o facendo gorgogliare il gas N2 attraverso la miscela di acrilammide.<ol><li>Aggiungere 2 mL di una soluzione di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 al 30% in una provetta da 15 mL senza tappo all'interno del contenitore anaerobico sigillato.</li>
		<li>Preparare un impasto concentrato di indurente al 10% (p/v) aggiungendo 0,5 g di indurente a 5 mL di PBS in una provetta da 15 mL. Lasciare il tappo staccato dal tubo e conservare nel contenitore anaerobico sigillato.</li>
		<li>Lasciare alcuni ml di PBS sterile in una provetta, senza tappo, all'interno del contenitore anaerobico.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare una soluzione di 5 mL di idrogel con una concentrazione finale di indurente allo 0,2% e 4% di acrilammide:bis-acrilammide 29:1 in PBS in una provetta da 15 mL. Miscelare per inversione e sterilizzare con filtro.</li>
	<li>Rimuovere i campioni di espettorato dal frigorifero, quindi tagliarli in piccole sezioni (circa 5 mm di diametro) in condizioni sterili con un bisturi. NOTA: Se l'espettorato è abbastanza fluido, questo passaggio può ancora essere eseguito, tuttavia, ci vuole maggiore pazienza e pratica per rimuovere l'espettorato dalla soluzione di conservazione con una pinzetta prima di utilizzare il bisturi per separare le frazioni desiderate.</li>
	<li>Posizionare i campioni di espettorato tagliati all'interno di un pozzetto di un vetrino di copertura a 8 camere.</li>
	<li>Aggiungere 300 μL di soluzione di idrogel sterilizzata con filtro della fase 2.2 a ciascuno dei pozzetti che contengono espettorato.</li>
	<li>Collocare il coperchio a 8 camere all'interno di un contenitore sigillato contenente un impacco anaerobico per 3 ore a 37 °C. NOTA: Una volta polimerizzato, l'idrogel con l'espettorato incorporato dovrebbe avere la consistenza di un gel solido.</li>
	<li>Trasferire i campioni di espettorato di idrogel solidificato in una provetta di coltura da 15 mL contenente 5 mL di sodio dodecil solfato (SDS) all'8%, pH 8, e lasciare che i campioni si chiariscano per 3-14 giorni a 37 °C (con o senza agitazione), fino a quando l'espettorato diventa trasparente. NOTA: I tempi di pulizia dipendono dalla composizione dell'espettorato e generalmente possono essere ridotti con l'agitazione. Tuttavia, fare attenzione a non aumentare la velocità di agitazione fino al punto di interrompere l'integrità del campione. I campioni più ricchi di DNA richiedono più tempo per essere eliminati rispetto ai campioni ricchi di muco.</li>
	<li>Travasare la soluzione SDS all'8% in un contenitore per la raccolta dei rifiuti. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire ogni campione incorporato in idrogel in una provetta conica sterile da 50 ml. Aggiungere 10 mL di PBS a ciascuna delle provette coniche da 50 mL per lavare gli idrogel e lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a 1 ora prima di travasare. Ripeti l'operazione altre 2 volte. NOTA: Questa fase di lavaggio non prevede centrifugazione. Il liquido in eccesso e il surnatante vengono accuratamente rimossi con una pipetta.</li>
	<li>Conservare i campioni lavati in PBS con sodio azide allo 0,01% (p/v) e 1x inibitore della RNasi a 4 °C.</li>
</ol>3. Protocollo di ibridazione in situ fluorescente idrogel (FISH)
<ol><li>Rimuovere i campioni di idrogel dalla soluzione di conservazione utilizzando una pinzetta sterile e posizionare i campioni su una superficie sterile (come un vetrino o una capsula di Petri).</li>
	<li>Utilizzando un bisturi sterile, tagliare gli idrogel in fette spesse ~ 1 mm.</li>
	<li>Posizionare le sezioni di idrogel da 1 mm all'interno di provette sterili da 1,5 mL.</li>
	<li>Preparare 1 mL di tampone di ibridazione (25% di formammide, 0,9 M NaCl, 20 mM di Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% di SDS, H2O purificato e deionizzato) in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere la sonda PseaerA marcata con fluorescenza (150,7 nM12) al tampone di ibridazione e miscelare per inversione. NOTA: La soluzione di formalina deve essere tenuta lontana da fiamme libere. Il tampone di ibridazione può essere preparato in anticipo e conservato in aliquote a -20 °C13.</li>
	<li>Aggiungere 200-500 μL di tampone di ibridazione a ciascuna sezione di ~1 mm di idrogel e assicurarsi che l'intero campione di idrogel sia immerso.</li>
	<li>Consentire alla sonda PseaerA di ibridarsi con i campioni di idrogel mettendoli al buio per ~ 18-24 h, a 46 °C, senza agitare.</li>
	<li>Travasare il tampone di ibridazione in un contenitore per la raccolta dei rifiuti.</li>
	<li>Sciacquare i campioni una volta con tampone di lavaggio sterilizzato con filtro (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) [pH 7,2], 0,01% SDS e H2O purificato e deionizzato) aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio a ciascuna delle provette da 1,5 mL e quindi rimuoverlo. NOTA: Il tampone di lavaggio può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio fresco alle provette, quindi incubare i campioni al buio per 6 ore a 48 °C, senza agitare.</li>
</ol>4. Idrogel e legame anticorpale Psl0096
<ol><li>Rimuovere sterilmente il tampone di lavaggio utilizzando un pipettitore da 1 ml.</li>
	<li>Sciacquare i campioni con una soluzione di BSA al 2% (p/v) in PBS aggiungendo e rimuovendo 1 mL di soluzione di BSA al 2%.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL della soluzione BSA/PBS al 2% ai campioni di idrogel per bloccare il legame proteico non specifico. Quindi incubare i campioni per una notte, al buio, a RT, senza agitare.</li>
	<li>Rimuovere sterilmente la soluzione bloccante utilizzando una pipetta da 1 ml.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red diluendo l'anticorpo a una concentrazione finale di 0,112 μg/mL in 500 μL di BSA/PBS fresco al 2%.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione anticorpale da 500 μL ai campioni di idrogel e incubarli a RT per 6 ore, al riparo dalla luce, senza agitare.</li>
</ol>5. Colorazione DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindolo)
<ol><li>Preparare la soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS) aggiungendo 40 g di mezzo a gradiente di densità non ionica, 30 μL di Tween20, 3 μg di sodio azide e 30 mL di PBS a un matraccio contenente un'ancoretta magnetica. Agitare la soluzione per 15 minuti su un agitatore magnetico o fino a completa dissoluzione.</li>
	<li>Filtro: sterilizzare la soluzione in una provetta conica da 50 mL utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro sterile da 0,2 μm. NOTA: La soluzione può essere conservata a 4 °C per diversi mesi.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di anticorpi Psl0096-Texas Red con una pipetta sterile da 1 mL.</li>
	<li>Sciacquare i campioni di idrogel aggiungendo e rimuovendo 1 ml di PBS.</li>
	<li>Incubare i campioni di idrogel con 250 μL di soluzione RIMS e 10 μg/mL di DAPI a RT agitando delicatamente, al buio, durante la notte.</li>
	<li>Prima dell'imaging confocale, montare i campioni su camere di perfusione da 0,9 mm o 1,7 mm e sigillare con un vetrino coprioggetto. NOTA: Dopo la FISH e/o l'immunoistochimica e prima dell'immersione in RIMS, è possibile applicare colorazioni fluorescenti di lectina se si desidera visualizzare la mucosa dell'espettorato12.</li>
</ol>6. Imaging
<ol><li>Eseguire l'imaging al microscopio a scansione laser confocale utilizzando tecniche standard con ingrandimenti 25x, 40x, 63x o 100x.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis:+What+drug+and+which+way.">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li><li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis:+Pathophysiology,+diagnosis,+and+management.">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li><li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics.">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).</li><li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms.">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).</li><li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides,+alginate,+Pel,+and+Psl.">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa.">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li><li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li><li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding,+clearing,+and+rRNA+labeling.">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li><li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis.">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li><li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens:+An+immunocytochemical+analysis.">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li><li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients.">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li><li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erratum:+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis.">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).</li><li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples.">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li><li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis.">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li><li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity.">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).</li></ol>

Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire uno sguardo sull'organizzazione in situ delle cellule di P. aeruginosa nell'espettorato di pazienti con fibrosi cistica. I campioni di espettorato devono essere conservati a 4 °C fino al momento dell'elaborazione, se non possono essere fissati immediatamente. È stato dimostrato che il numero di cellule di P. aeruginosa nell'espettorato non cambia in modo significativo se processato a 1 ora, 24 ore o 48 ore, se conservato a 4 °C, anche se lasciato ...

In questo studio, gli esperimenti sono stati progettati per visualizzare la struttura in vivo di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti pediatrici affetti da fibrosi cistica (FC). Le infezioni da P. aeruginosa diventano croniche nel 30-40% della popolazione pediatrica FC; Una volta che le infezioni croniche si sono stabilite, sono quasi impossibili da eliminare1. Gli isolati di P. aeruginosa provenienti da pazienti con infezione precoce sono generalmente più suscettibili agli antimicrobici, pertanto vengono trattati con antibiotici anti-pseudomonali per prevenire l'instaurarsi di infezioni croniche2. Sfortunatamente, non tutti gli isolati di P. aeruginosa vengono eliminati efficacemente dal polmone dopo la terapia antibiotica. I meccanismi precisi associati al fallimento degli antibiotici non sono stati completamente chiariti. Studi precedenti hanno dimostrato che le variazioni nella densità cellulare del biofilm, nell'aggregazione e nella produzione di polisaccaridi possono influenzare l'efficacia degli antibiotici3. P. aeruginosa produce tre polisaccaridi extracellulari: Pel, Psl e alginato4. La maggior parte dei ceppi di P. aeruginosa ha la capacità genetica di esprimere ciascuno degli esopolisaccaridi, anche se spesso un tipo di polisaccaride è espresso prevalentemente5. L'alginato di esopolisaccaride è associato a infezioni croniche nel polmone FC, con conseguente fenotipomucoide 6,7. I polisaccaridi Pel e Psl hanno molteplici funzioni, tra cui aiutare l'attacco iniziale e il mantenimento della struttura del biofilm e conferire resistenza agli antibiotici8.
Sono stati sviluppati metodi volti a visualizzare in vivo le strutture dei tessuti per una varietà di tipi di campioni 9,10,11. Più recentemente, sono stati adattati per visualizzare le comunità microbiche in vivo all'interno dell'espettorato di pazienti con FC12. L'ottimizzazione di un protocollo di pulizia tissutale specifico per l'identificazione delle comunità microbiche all'interno dell'espettorato è stata sviluppata da DePas et al., 201612. Il termine MiPACT, che sta per identificazione microbiale dopo la tecnica di Passive CLARITY, è stato coniato per la rimozione dell'espettorato FC11,12. Per le tecniche di purificazione dei tessuti, i campioni vengono prima fissati, quindi resi trasparenti, lasciando intatta la loro architettura intrinseca per la colorazione e la visualizzazione microscopica11. La fissazione e la cancellazione dei campioni di espettorato FC consentono ai ricercatori di rispondere a domande relative alla struttura del biofilm, alla densità delle cellule batteriche, alle associazioni polimicrobiche e alle associazioni tra agenti patogeni e cellule ospiti. Il vantaggio di esaminare direttamente i batteri che sono stati conservati all'interno dell'espettorato è che possono essere analizzati e visualizzati in un contesto specifico dell'ospite. Sebbene la crescita in vitro di isolati clinici in laboratorio per la sperimentazione possa essere molto istruttiva, tali metodi non sono in grado di ricreare completamente l'ambiente polmonare della fibrosi cistica, con conseguente disconnessione tra i risultati di laboratorio e gli esiti dei pazienti.
I metodi qui presentati possono essere utilizzati per fissare e liberare l'espettorato per visualizzare i batteri, sia di pazienti FC che di pazienti con altre infezioni respiratorie. Il tipo specifico di colorazione e analisi microscopica qui descritto è l'ibridazione fluorescente in situ (FISH), seguita dal legame anti-Psl-anticorpo all'interno dell'idrogel e dalla successiva analisi tramite microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Dopo la pulizia dei tessuti, possono essere applicati anche altri metodi di immunoistochimica e microscopia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerogen2.5L</td>
			<td>Oxid Inc.</td>
			<td>35108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverwell perfusion chambers</td>
			<td>Electron Microscopry Sciences</td>
			<td>70326 -12/-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoDenz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td></td>
			<td>Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Psl0096-Texas Red</td>
			<td>Medimmune</td>
			<td></td>
			<td>The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VA-044 Hardener</td>
			<td>Wako</td>
			<td>27776-21-21</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of pseudomonas aeruginosa within the sputum of cystic fibrosis patients

La diagnosi precoce e l'eradicazione di Pseudomonas aeruginosa nei polmoni dei pazienti affetti da fibrosi cistica possono ridurre la possibilità di sviluppare un'infezione cronica. Lo sviluppo di infezioni croniche da P. aeruginosa è associato a un declino della funzione polmonare e a un aumento della morbilità. Pertanto, c'è un grande interesse a chiarire le ragioni della mancata eradicazione di P. aeruginosa con la terapia antibiotica che si verifica in circa il 10-40% dei pazienti pediatrici. Uno dei molti fattori che possono influenzare la clearance dell'ospite di P. aeruginosa e la suscettibilità agli antibiotici sono le variazioni nell'organizzazione spaziale (come l'aggregazione o la formazione di biofilm) e nella produzione di polisaccaridi. Pertanto, eravamo interessati a visualizzare le caratteristiche in situ di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti con FC. Una tecnica di pulizia dei tessuti è stata applicata ai campioni di espettorato dopo aver incorporato i campioni in una matrice di idrogel per mantenere le strutture 3D relative alle cellule ospiti. Dopo la pulizia dei tessuti, sono state aggiunte etichette fluorescenti e coloranti per consentire la visualizzazione. L'ibridazione fluorescente in situ è stata eseguita per la visualizzazione di cellule batteriche, il legame di anticorpi anti-Psl marcati in modo fluorescente per la visualizzazione dell'esopolisaccaride e la colorazione DAPI per colorare le cellule ospiti per ottenere informazioni strutturali. Questi metodi hanno permesso l'imaging ad alta risoluzione di P. aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da FC tramite microscopia confocale a scansione laser.

Il disegno generale dell'esperimento è riassunto nella Figura 1 e nella Figura 2. La Figura 1 fornisce un riepilogo dei protocolli di elaborazione e di eliminazione dell'espettorato. L'elaborazione e la rimozione dell'espettorato possono richiedere fino a 17 giorni. Tuttavia, il protocollo può essere interrotto e i campioni possono essere conservati dopo la fissazione con PFA (giorno 2) o dopo la pulizia dei tessuti (giorni 5-17 a...

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Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

2.9K Views.  Hospital for Sick Children. Questo protocollo fornisce metodi per la visualizzazione delle cellule batteriche e del polisaccaride del locus di sintesi dei polisaccaridi (Psl) all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-coltura Modelli di Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cresciuto in diretta cellule delle vie aeree umane

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa e biofilm Saccharomyces cerevisiae in celle di flusso

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replica di ordinato, Nonredundant biblioteca del ceppo di Pseudomonas aeruginosa PA14 trasposone inserimento mutanti

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica di Pseudomonas aeruginosa Wound

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...