אנו מכירים את מאיו קליניק מיקרוסקופיה ניתוח תאים הליבה Cytometry מתקן לסיוע עם מיון FACS.

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מאיו קליניק.
1. הכנת פתרון 
<ol><li>הכן קולאז 2% (w / v) פתרון על ידי המסת קולגנאז II 2 גרם ב 100 מ"ל הנקס' פתרון מלח מאוזן (HBSS). Aliquot 200 μL כל אחד לכל שימוש.</li>
	<li>הכן מדיום נטרול על ידי ערבוב 84 מ"ל F-12 בינוני, 15 מ"ל סרום סוס, ו 1 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין.</li>
	<li>הכן מאגר cytometry זרימה על ידי המסת 500 מ"ג של אלבומין סרום שור (BSA) ו 400 μL של 0.5 M EDTA ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. ניתוח של כרית שומן אפידילית ניתוק רקמות
<ol><li>המתת חסד אנושית (נקע isoflurane / צוואר הרחם) עכבר זכר אחד. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכבר FVB בן ארבעה חודשים.</li>
	<li>יש למרוח/לרסס 70% אתנול על הבטן ולחשוף את חלל הבטן התחתון באמצעות מספריים נקיים ומלקחיים.</li>
	<li>אתר כרית שומן אפידילית (פרוקסימלית / מחוברת לאשכים). להחזיק את הצומת בין האשכים כרית שומן epididymal עם מלקחיים קהים למשוך בעדינות כדי לשחרר את כרית שומן epididymal.</li>
	<li>הסר אשכים על ידי חיתוך באמצעות מספריים כרית שומן אפידילית דגירה ב 5 מ"ל של HBSS בתוספת 3% BSA בצינור חרוט 50 מ"ל בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>קח כרית שומן אפידילית צפה מצינור חרוט 50 מ"ל וטחון דק את הרקמה באמצעות מספריים נקיים.</li>
	<li>הוסף 200 μL קולגנאז 2% פתרון לתוך 3.8 מ"ל של HBSS בצינור תרבות 13 מ"ל. מוסיפים את הרקמה הטחונית ואת הדגירה באינקובטור מסתובב ב 5 סל"ד עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. במקום אינקובטור מסתובב, חממת תרבית תאים ב 37 °C (69 °F) ניתן להשתמש לחילופין עם תסיסה מדי פעם.</li>
	<li>מעבירים את כל התוכן לצינור חרוט של 50 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום נטרול. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.</li>
	<li>הכן עוד צינור חרוט 50 מ"ל מצויד מסננת תאים 70 מיקרומטר. לסנן את הרקמה המתעכלת לתוך הצינור החדש באמצעות מסננת התא.</li>
	<li>להעביר את הזרימה דרך צינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את כדורי תא supernatant ו resuspend עם 5 מ"ל של DPBS. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בזהירות להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μL של מאגר cytometry זרימה. מערבבים היטב על ידי pipeting בעדינות ולשמור על התאים על הקרח. בשל נפח כדורי התא וכמות קטנה של supernatant שיורית, נפח כולל של תאים במאגר cytometry זרימה יהיה גדול מ 50 μL (כ 100 μL).</li>
</ol>3. תיוג נוגדנים ופלואורסצנטיות מופעל מיון תאים (FACS)
<ol><li>לאחר ערבוב התאים היטב עם pipetting עדין, להעביר 54 μL של המתלה התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. הוסף 6 μL של מגיב חסימת FcR ומערבבים היטב על ידי pipetting בעדינות. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. שמור את כל התאים שנותרו לאחר נטילת 54 μL ולשמור אותם בקרח להשתמש כשליטה מוכתמת בשלב 3.5 וצעד 3.6.</li>
	<li>במהלך הדגירה בשלב 3.1, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי שילוב של 11 μL כל אחד נוגדנים אנטי סקא1-APC, אנטי Ter119-FITC, אנטי CD31-FITC, נוגדנים נגד CD45-FITC בצינור microcentrifuge. מערבבים היטב על ידי צינור עדין ולשמור על קרח מוגן מפני אור.</li>
	<li>לאחר הדגירה עם FcR חסימת ריאגנט במשך 10 דקות, להוסיף 40 μL של קוקטייל הנוגדנים ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה בתוספת 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI לתוך התאים המוכתמים. מערבבים היטב על ידי צינור עדין לתאי סינון באמצעות מבחנה 5 מ"ל עם כובע הצמדה מסננת תאים. שמור תאים על קרח.</li>
	<li>הוסף 500 μL של מאגר cytometry זרימה לתאים הנותרים בשלב 3.1 ומערבבים היטב על ידי pipetting עדין. סנן תאים באמצעות מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה הצמדה למסננת תאים. שמור תאים אלה על הקרח ולהשתמש כפקד מוכתם בשלב הבא.</li>
	<li>קח את התאים המוכתמים ואת השליטה הבלתי מוכתמת לניתוח FACS או למכשיר מיון.<ol>
<li>זהה ובודד את אוכלוסיית APC+/FITC-/DAPI- עם אסטרטגיות גטינג המוצגות באיור 1. תאים אלה מייצגיםתאים מעשיים מסוג Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45. פסולת וצבירות תאים מתרוקנות באמצעות החלקות קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC). לאחר מכן, DAPI- האוכלוסייה מגודרת, ואחריו gating של APC+/ FITC- אוכלוסייה. יש להשתמש בפקדים לא מוכתמים כדי לסייע בהגדרת פרמטרי gating.</li>
		<li>לאסוף את התאים לתוך 500 μL של חיץ cytometry זרימה בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בהמשך, כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים כדי למזער זיהום. כ 50,000 – 100,000 תאים נאספים מעכבר אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי להעריך את הכדאיות של התא. מאחר שצבירות תאים עלולות להפריע לניתוחים נוספים במורד הזרם, נוכחותם של צבירות תאים מוערכת גם היא כדי להבטיח נוכחות מינימלית (<5% ממספר התאים בר-הקיימא) של אגרגטים אלה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

רצף RNA של תא יחיד (scRNA-seq) צובר תאוצה במהירות ככלי רב עוצמה לחקור בו זמנית אוכלוסיות תאים מגוונות ברמת התא הבודד. בשל עלויות גבוהות הקשורות להכנת מדגם רצף תפוקה גבוהה, זה הכרחי כדי לייעל את התשומות הסלולר (כדאיות גבוהה וטוהר) כדי להגדיל את הסבירות להצלחה ניסיונית. פרוטוקולים מסוימים להכנת תאים מסתמכים על הסרת תאים מתים ופסולת באמצעות שטיפות ספין נמוך והפרדה מבוססת עמודה ללאFACS מיון 14. עם זאת, רבות משיטות אלה מפחיתות באופן משמעותי את מספר התאים המשוחזרים, ובמקרים רבים, תאים מתים אינם מוסרים לחלוטין14. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד תאי Sca1+ אב שומן המכילים פסולת תאית מינימלית, כפילויות תאים ותאים מתים. למרות שתאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה הפגינו כדאיות גבוהה, אנו עדיין ממליצים למזער את הזמן בין בידוד התאים וניתוח נוסף במורד הזרם כדי לשמור על כדאיות גבוהה. בנוסף, תיוג נוגדנים מוצלח הוא קריטי כדי לבודד Sca1+ תאי אב שומן עם טוהר גבוה. לפיכך, קביעת ריכוז אופטימלי של נוגדנים מומלץ מאוד עבור כל נוגדן, ודילול של הנוגדנים בשלב 3.2 ניתן להתאים בהתאם.
פרוטוקול מבוסס ציטומטריית זרימה זה נוח להתאמה אישית בהתאם לעניין פרטני באוכלוסיות משנה ספציפיות של תאים אב שומן. כאן, שילובי נוגדנים חלופיים יכולים לשמש כדי לזהות ולבודד את האוכלוסייה של עניין. ואכן, בשל מגוון נרחב של סמן APC, מעבדות מרובות החוקרות נגמ"שים באמצעות scRNA-seq מדווחות על בידוד תאים באמצעות סמני שטח אחרים. לדוגמה, PDGFRA+/CD44+ תאים, CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+ תאים, ותאי Pdgfrb+ בודדו על ידי FACS עבור ניתוחי APC scRNA-seq במורד הזרם8,9,11. CD142+ תתי-אוכלוסיות התאפיינו גם הן והוכח כי הן מציגות יכולת בידול אדיפוגנית מוגבלת ויכולת לדכא אדיפוגנזה10,11. בנוסף Sca1, שילובים של נוגדנים נגד CD55, CD81, ו CD9 שימשו לאחרונה כדי לבודד פוטנציאלית ASC ו preadipocyte תת-אוכלוסיות (באמצעות פרוטוקול זה) ו מחקר תת אוכלוסיית הטרוגניות מולקולרית ותפקודית7. יתר על כן, מאז תאי אב שומן מרפידות שומן אחרות כולל רפידות שומן מפשעתי ורקמות שומן חום בודדו באמצעות דיסוציאציה קולגנאז כמו הפרוטוקול הנוכחי15,16,17, הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיות ישים לבידוד של תאי אב שומן מרקמות שומן אחרות.
אזהרה אחת של הגישה הנוכחית היא שהיא מותאמת לבידוד של נגמ"שים לא בוגרים. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מניב נגמ"שים בעלי כדאיות גבוהה, היעילות והיעילות של בידוד של סוגי תאים אחרים של רקמת שומן (כלומר, תאים חיסוניים, פיברובלסטים, תאי אנדותל וכו') אינה ברורה. חשוב לציין, פרוטוקול זה אינו מתאים לבידוד של אדיפוציטים בוגרים. Adipocytes היו קשים מאוד לבודד באמצעות FACS בשל גודל התא הגדול שלהם שבריריות. לאחרונה, בידוד של adipocytes בוגרת על ידי FACS דווח באמצעות גודל זרבובית גדולה (150 מיקרומטר) ולחץ נדן נמוך (6 psi) עם אסטרטגיה ספציפית FSC / SSC gating18. מחקרים עתידיים יכולים אולי למזג פרוטוקול בידוד adipocyte זה עם הפרוטוקול המתואר כאן כדי להקים צינור מקיף יותר כדי לבודד וללמוד סוגי תאים מגוונים בתוך רקמת שומן.

רקמת שומן ממלאת תפקיד מפתח בחילוף החומרים של האנרגיה. עודף אנרגיה מאוחסן בצורה של שומנים, ורקמת שומן מסוגל התרחבות משמעותית או נסיגה בהתאם למצב תזונתי וביקוש אנרגטי. הרחבת רקמת השומן יכולה לנבוע מגידול בגודל adipocyte (היפרטרופיה) ו/או מעלייה במספר adipocyte (היפרפלזיה); התהליך האחרון מוסדר בחוזקה על ידי התפשטות ובידול של תאים אב שומן1,2. במהלך השמנת יתר, רקמת השומן מתרחבת יתר על המידה, ותפקוד לקוי של רקמות – כולל היפוקסיה, דלקת ועמידות לאינסולין – מתפתח לעתיםקרובות 3,4. סיבוכים אלה הם גורמי סיכון למחלות כרוניות רבות כולל יתר לחץ דם, סוכרת, מחלות לב וכלידם, שבץמוחי וסרטן 5 . לפיכך, הגבלת הרחבת רקמת שומן בלתי מבוקרת והפתולוגיות של רקמת שומן מקלות הן בראש סדר העדיפויות המחקרי הביו-רפואי. במהלך הרחבת רקמת השומן, תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ASCs) מתרבים ומבדילים ברצף לתוך preadipocytes (תאי אב מחויבים) ולאחר מכן לתוך adipocytesבוגרת 6. מחקרים אחרונים על רצף רנ"א חד-תאי (scRNA-seq) מראים כי אוכלוסיות אלה של תאי אב שומן (APC) (ASCs ו preadipocytes) מפגינים הטרוגניות מולקולרית ופונקציונלית משמעותית7,8,9,10,11,12. לדוגמה, ASCs מציגים יכולת בידול אדיפוגנית מופחתת, תוך הפגנת יכולות התפשטות והרחבה גבוהות יותר, בהשוואה ל- preadipocytes7. הבדלים מולקולריים נוספים מדווחים בתוך ASC ואוכלוסיות preadipocyte, אם כי הרלוונטיות התפקודית של הבדלים אלה עדיין לא ברור7. יחד, נתונים אלה מדגישים את המורכבות של מאגר התאים האב השומן ומדגישים את הצורך לפתח ולתקנן כלים כדי להבין ולטפל טוב יותר באוכלוסיות תאים קריטיות אלה.
פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של Sca1+ אוכלוסיות תאים אב שומן אדידימאלי העכבר המתאימים ניתוחים רגישים במורד הזרם, כולל מחקרים חד-תאיים (scRNA-רצף) ותרבות התא. בידוד ודיסוציאציה של רפידות שומן אפידיליות בוצעו כפי שתואר קודם לכן7,13 עם שינויים קלים המשפרים את הכדאיות של נגמ"שים מבודדים. בקצרה, תאים מנותקים מרפידות שומן אפידימליות מוכתמים בנוגדנים נגד Sca1, סמן הן עבור ASCs והן עבור preadipocytes6,7, וסמני שושלת אחרים (לין): Ter119 (תאי אריתרואיד), CD31 (תאי אנדותל), ו- CD45 (לויקוציטים). Sca1+/Ter119קיימא -/CD31-/CD45-/DAPI- תאים ממוינים לאחר מכן לפי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). חשוב לציין, פרוטוקול זה אומת על ידי בידוד וניתוח מוצלחים של Sca1+/ Linקיימא - תאי אב שומן דיווחו במחקר רצף RNA תא יחיד האחרון שזיהה תת-אוכלוסיות הטרוגניות תפקודית בתוך ASCs ו preadipocytes7.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL culture tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL test tube with cell strainer snap cap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1-APC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

השמנת יתר והפרעות מטבוליות כגון סוכרת, מחלות לב וסרטן, כולם קשורים לשיפוץ דרמטי של רקמת השומן. תאים אב שומן תושב רקמה (נגמ"שים) לשחק תפקיד מפתח הומאוסטזיס רקמת שומן והוא יכול לתרום פתולוגיה רקמה. השימוש הגובר בטכנולוגיות ניתוח תאים בודדים – כולל רצף רנ"א חד-תאי ופרוטאומיקה של תא יחיד – משנה את שדה תאי הגזע/אב בכך שהוא מאפשר רזולוציה חסרת תקדים של שינויים בודדים בביטוי התא בהקשר של שינויים באוכלוסייה או ברקמות. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי לנתח רקמת שומן אפידימלית של העכבר, לבודד תאים בודדים שמקורם ברקמת שומן, ולבצע מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי להעשיר עבור Sca1+/CD31קיימא -/CD45-/Ter119- נגמ"שים. פרוטוקולים אלה יאפשרו לחוקרים להכין נגמ"שים באיכות גבוהה המתאימים לניתוחים במורד הזרם כגון רצף RNA של תא יחיד.

בניסוי זה נעשה שימוש בעכברי FVB זכרים בני ארבעה חודשים. לאחר הדרה של פסולת וכפולים באמצעות חלקות FSC / SSC, תאים קיימא (DAPI- אוכלוסייה) היו מגודרים, ואחריו הבחירה של APC+/ FITC- אוכלוסייה (איור 1). שערי DAPI, APC ו- FITC צוירו בהתבסס על הפקד הבלתי מוכתם. אסטרטגיות גטינג מוצגות באיור 1.
לאחר שעה של מיון, איכות הבידוד הוערכה כמותית על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה (איורים 2,3). התאים היו מוכתמים בתמיסת פרופידיום יודיד (1:100) עבור כתמי הכדאיות. באמצעות אותו גיתור למיון, התאים שמרו על כדאיות גבוהה וטוהר: 92.6 ± 2.2% תאים בודדים (פאנל שלישי באיור 2),86.4 ± 3.0% כדאיות (PI- תאים), ו- 86.0 ± 2.8% APC+/ FITC- תאים (n = 4, ממוצע ± סטיית תקן). אחוזים אלה הוגדרו כאחוזים של כל אוכלוסייה מגודרת (תאים בודדים, PI- תאיםו-PI - /APC+/FITC- אוכלוסייה, בהתאמה, באיור 2) ביחס למספר התא הכולל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61694/61694fig1v2.jpg"> איור 1: בידוד של Sca1 בר קיימא+ תאים בודדים אב שומן על ידי FACS. אסטרטגיות גטינג מוצגות הן בתאים מוכתמים והן בשליטה לא מוכתמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61694/61694fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61694/61694fig2v2.jpg"> איור 2: ניתוח cytometry זרימה מייצג כדי להעריך את הכדאיות של תאים לאחר הבידוד. כתמי הכדאיות בוצעו באמצעות יודיד פרופידיום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61694/61694fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61694/61694fig3.jpg"> איור 3: כימות אחוז התאים 1 שעות לאחר הבידוד בניתוח ציטומטריית זרימה. אחוזים של תאים בודדים, תאים בני קיימא, ו- APC+/ FITC- תאים כמתו כדי להעריך טוהר וכדאיות לאחר בידוד של תאים. הנתונים המוצגים מייצגים את סטיית התקן ± הממוצעת. n=4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61694/61694fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

5.6K Views.  Mayo Clinic. אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד תאי אב שומן קיימא מאוד מרפידות שומן אפידיליות עכבר באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.

Video: Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Developmental Biology

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד ועיבוד של אדיפוציטים לבנים של עכברים לניתוח טרנסקריפטום ואפיגנום

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

בידוד ועיבוד של אדיפוציטים לבנים של עכברים לניתוח טרנסקריפטום ואפיגנום

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

Genetics

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Immunology and Infection

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance contributes to the development of type 2 diabetes (T2D) and other obesity-derived diseases of high prevalence worldwide. Therefore, understanding the mechanisms underlying insulin resistance is of great relevance. Several models have been used to study insulin resistance both in vivo and in vitro; primary adipocytes represent an attractive option to study the mechanisms of insulin resistance and identify molecules that counteract this condition and the molecular targets of insulin-sensitizing drugs. Here, we have established an insulin resistance model using primary adipocytes in culture treated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;).
Adipocyte precursor cells (APCs), isolated from collagenase-digested mouse subcutaneous adipose tissue by magnetic cell separation technology, are differentiated into primary adipocytes. Insulin resistance is then induced by treatment with TNF-&#945;, a proinflammatory cytokine that reduces the tyrosine phosphorylation/activation of members of the insulin signaling cascade. Decreased phosphorylation of insulin receptor (IR), insulin receptor substrate (IRS-1), and protein kinase B (AKT) are quantified by western blot. This method provides an excellent tool to study the mechanisms mediating insulin resistance in adipose tissue.

This protocol describes the isolation of mouse preadipocytes from subcutaneous fat, their differentiation into mature adipocytes, and the induction of insulin resistance. Insulin action is evaluated by the phosphorylation/activation of members of the insulin signaling pathway through western blot. This method allows direct determination of insulin resistance/sensitivity in primary adipocytes.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

גידול פרא-אדיפוציטים שבודדו מרקמת שומן פרי-וסקולרית מורין

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Author Spotlight: The Significance of Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of SVF-Derived Preadipocytes from Mouse Perivascular Edipose Tissue 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

בידוד ועיבוד של אדיפוציטים לבנים של עכברים לניתוח טרנסקריפטום ואפיגנום

בידוד ועיבוד של אדיפוציטים לבנים של עכברים לניתוח טרנסקריפטום ואפיגנום

בידוד, הרחבה, אינדוקציה Adipogenic CD34 + CD31 + תאי אנדותל של אדם עם פגיעה ו התת-עורית שומן

בידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני שומן תוך-בטניים של מורין

בידוד ובידול של Preadipocytes לבן וחום ראשוני מעכברים שזה עתה נולדו

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר

בידוד, תרבית ואינדוקציה אדיפוגנית של פרדיפוציטים שמקורם בשבר כלי דם סטרומה מרקמת שומן פריאורטית של עכבר