Wir würdigen die Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility für Unterstützung bei der FACS-Sortierung.

Alle tierexperimentellen Verfahren wurden unter Genehmigung des Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee durchgeführt.
1. Lösungsvorbereitung 
<ol><li>Bereiten Sie Kollagenase 2% (w/v) Lösung durch Auflösen von Kollagenase II 2 g in 100 ml Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS). Aliquot 200 l für jede Verwendung.</li>
	<li>Vorbereiten Sie neutralisationsmedium durch Mischen von 84 ml F-12 medium, 15 ml Pferdeserum und 1 ml Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Vorbereiten Sie den Puffer für die Durchflusszytometrie, indem Sie 500 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 400 l 0,5 M EDTA in 100 ml Phosphat-gepufferter Kochchen (DPBS) von Dulbecco auflösen.</li>
</ol>2. Dissektion des epididymalen Fettpolsters und der Gewebedissoziation
<ol><li>Humane euthanize (Isoflurane/zervikale Dislokation) eine männliche Maus. In diesem Protokoll wurde eine vier Monate alte FVB-Maus verwendet.</li>
	<li>70% Ethanol auf den Bauch auftragen/sprühen und die untere Bauchhöhle mit sauberer Schere und Zange aussetzen.</li>
	<li>Suchen Sie epididymales Fettpolster (proximal/an Hoden befestigt). Halten Sie die Kreuzung zwischen Hoden und epididymale Fettpad mit stumpfer Zange und ziehen Sie sanft, um das epididymale Fettpolster zu befreien.</li>
	<li>Entfernen Sie die Tests durch Schneiden mit einer Schere und inkubieren epididymalen Fettpolster in 5 ml HBSS ergänzt mit 3% BSA in einem 50 ml konischen Rohr bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Zentrifuge bei 150 x g für 7 min bei 4 °C.</li>
	<li>Nehmen Sie das schwimmende epididymale Fettpolster aus dem 50 ml konischen Rohr und zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sauberen Schere.</li>
	<li>Fügen Sie 200 l Kollagennase 2% Lösung in 3,8 ml HBSS in einem 13 ml Kulturrohr hinzu. Das gehackte Gewebe hinzufügen und in einem rotierenden Inkubator bei 5 Umdrehungen pro Minute für 1 h bei 37 °C brüten. Anstelle eines rotierenden Inkubators kann der Zellkultur-Inkubator bei 37 °C alternativ mit gelegentlichen Rührungen verwendet werden.</li>
	<li>Den gesamten Inhalt in ein 50 ml konisches Rohr übertragen und 10 ml Neutralisationsmedium hinzufügen. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr 2-3 mal invertieren.</li>
	<li>Bereiten Sie ein weiteres 50 ml konisches Rohr vor, das mit einem 70 m Zellsieb ausgestattet ist. Filtern Sie das verdaute Gewebe mit dem Zellsieb in das neue Rohr.</li>
	<li>Übertragen Sie den Durchfluss in ein 15 ml kegelförmiges Rohr und zentrifugieren bei 350 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und setzen Sie Zellpellets mit 5 ml DPBS wieder auf. Zentrifuge bei 350 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fügen Sie 50 L Durchflusszytometriepuffer hinzu. Gut mischen, indem Sie sanft pfeifen und Zellen auf Eis halten. Aufgrund des Volumens der Zellpellets und der geringen Menge an Restüberstand wird das Gesamtvolumen der Zellen im Durchflusszytometriepuffer größer als 50 l (ca. 100 l) sein.</li>
</ol>3. Antikörperkennzeichnung und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)
<ol><li>Nach dem Mischen der Zellen gut mit sanfter Pipettierung 54 l der Zellsuspension in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie 6 l FcR blockierendes Reagenz hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie sanft pipetieren. Bei 4 °C für 10 min inkubieren. Speichern Sie alle übrig gebliebenen Zellen nach der Einnahme von 54 l und halten Sie sie im Eis, um sie als unbefleckte Kontrolle in Schritt 3.5 und Schritt 3.6 zu verwenden.</li>
	<li>Bereiten Sie während der Inkubation in Schritt 3.1 einen Antikörpercocktail zu, indem Sie jeweils 11 L Anti-Sca1-APC, Anti-Ter119-FITC, Anti-CD31-FITC und Anti-CD45-FITC-Antikörper in einem Mikrozentrifugenrohr kombinieren. Durch sanftes Pipettieren gut mischen und auf Eis vor Licht geschützt halten.</li>
	<li>Nach der Inkubation mit FcR-Blockierreagenz für 10 min, fügen Sie 40 l des Antikörper-Cocktails hinzu und mischen Sie gut durch sanfte Pipetten. Bei 4 °C für 10 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie den gebeizten Zellen 500 l Durchflusszytometriepuffer hinzu, der durch 1 g/ml DAPI ergänzt wird. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettier- und Filterzellen mit einem 5 ml Reagenzglas mit Zellsieb-Snap-Cap. Halten Sie Zellen auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie den verbleibenden Zellen in Schritt 3.1 500 l Durchflusszytometriepuffer hinzu und mischen Sie sie gut durch sanfte Pipettierung. Filtern Sie Zellen mit einem 5 ml Reagenzglas mit Zellsieb-Snap-Cap. Halten Sie diese Zellen auf Eis und verwenden Sie als unbefleckte Kontrolle im folgenden Schritt.</li>
	<li>Nehmen Sie die gefärbten Zellen und die ungefärbte Kontrolle zum FACS-Analyse- oder Sortierinstrument.<ol>
<li>Identifizieren und isolieren Sie die APC+/FITC-/DAPI- Grundgesamtheit mit Gating-Strategien, die in Abbildung 1dargestellt sind. Diese Zellen stellen lebensfähige Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- Zellen dar. Trümmer und Zellaggregate werden mit Vorwärts- (FSC) und Side Scatter (SSC)-Plots aufgebraucht. Dann wird DAPI- Population abgegrenzt, gefolgt von gating von APC+/FITC- Population. Ungefärbte Kontrollen sollten verwendet werden, um bei der Festlegung von Gating-Parametern zu helfen.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen in 500 l Durchflusszytometriepuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. In Zukunft sollten alle Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, um eine Kontamination zu minimieren. Etwa 50.000 – 100.000 Zellen werden aus einer Maus gesammelt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer, um die Zelllebensfähigkeit zu bewerten. Da Zellaggregate weitere nachgelagerte Analysen stören können, wird auch das Vorhandensein von Zellaggregaten bewertet, um eine minimale Präsenz (<5% der lebensfähigen Zellzahl) dieser Aggregate zu gewährleisten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Sequenzierung der einzelnen Zell-RNA (scRNA-seq) gewinnt schnell an Zugkraft als leistungsstarkes Werkzeug, um gleichzeitig verschiedene Zellpopulationen auf Einzelzellebene zu untersuchen. Aufgrund der hohen Kosten im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung und der Sequenzierung des hohen Durchsatzes ist es unerlässlich, die zellulären Eingänge (hohe Lebensfähigkeit und Reinheit) zu optimieren, um die Wahrscheinlichkeit eines experimentellen Erfolgs zu erhöhen. Einige Zellvorbereitungsprotokolle beruhen auf der...

Adipose-Gewebe spielt eine Schlüsselrolle im Energiestoffwechsel. Überschüssige Energie wird in Form von Lipiden gespeichert, und Fettgewebe ist in der Lage, signifikante Expansion oder Rückzug je nach Ernährungszustand und energetischen Bedarf. Die Ausweitung des Fettgewebes kann aus einer Erhöhung der Adipozytengröße (Hypertrophie) und/oder aus einer Erhöhung der Adipozytenzahl (Hyperplasie) resultieren; letzteres Verfahren streng reguliert durch Proliferation und Differenzierung der Fettvorläuferzellen1,2. Während der Fettleibigkeit, Fettgewebe übermäßig erweitert, und Gewebedysfunktion – einschließlich Hypoxie, Entzündung, und Insulinresistenz – entwickelt oft3,4. Diese Komplikationen sind Risikofaktoren für viele chronische Krankheiten wie Bluthochdruck, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Schlaganfall und Krebs5. Daher sind die Begrenzung der unkontrollierten Fettgewebeexpansion und die Milderung von Fettgewebepathologien oberste biomedizinische Forschungsprioritäten. Während der Fettgewebeexpansion vermehren sich die aus dem Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen (ASCs) und differenzieren sich sequenziell in Präsipozyten (verpflichtete Vorläuferzellen) und dann in reife Adipozyten6. Jüngste einzellige RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA-seq) zeigen, dass diese Adipose-Vorläuferzellpopulationen (APC) (ASCs und Preadipozyten) eine erhebliche molekulare und funktionelle Heterogenität7,8,9,10,11,12aufweisen. AsCs weisen beispielsweise eine reduzierte adipogene Differenzierungskapazität auf und weisen im Vergleich zu Denreadipozyten7auch höhere Proliferations- und Erweiterungsfähigkeiten auf. Weitere molekulare Unterschiede werden innerhalb der ASC- und Präsipozytenpopulationen berichtet, obwohl die funktionelle Relevanz dieser Unterschiede unklar bleibt7. Zusammen unterstreichen diese Daten die Komplexität des Fettvorläuferzellpools und unterstreichen die Notwendigkeit, Tools zu entwickeln und zu standardisieren, um diese kritischen Zellpopulationen besser zu verstehen und zu manipulieren.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von hochlebensfähigen Sca1+ Fettvorläuferzellpopulationen von mausepididymalen Fettpolstern, die für empfindliche nachgeschaltete Analysen geeignet sind, einschließlich einzelliger Studien (ScRNA-Sequenzierung) und Zellkultur. Die Isolierung und Dissoziation von epididymalen Fettpolstern wurde wie zuvor beschrieben7,13 mit leichten Modifikationen durchgeführt, die die Lebensfähigkeit isolierter APCs verbessern. Kurz gesagt, dissoziierte Zellen von epididymalen Fettpolstern werden mit Antikörpern gegen Sca1, einem Marker für ASCs und Prereadipocyten6,7, und andere Lineage (Lin) Marker: Ter119 (Erythroid-Zellen), CD31 (Endothelzellen) und CD45 (Leukozyten) gefärbt. Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- Zellen werden dann nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. Wichtig ist, dass dieses Protokoll durch erfolgreiche Isolierung und Analyse lebensfähiger Sca1+/Lin- Fettvorläuferzellen validiert wurde, die in einer kürzlich durchgeführten einzelzelligen RNA-Sequenzierungsstudie berichtet wurden, die funktionell heterogene Subpopulationen innerhalb von ASCs und Preadipozyten7identifizierte.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL culture tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL test tube with cell strainer snap cap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1-APC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC antibody</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcR blocking reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; balanced salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

Adipositas und Stoffwechselstörungen wie Diabetes, Herzerkrankungen und Krebs sind alle mit einer dramatischen Umgestaltung des Fettgewebes verbunden. Geweberesidente Fettvorläuferzellen (APCs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Adipinengewebehomöostase und können zur Gewebepathologie beitragen. Der zunehmende Einsatz von Einzelzellanalysetechnologien – einschließlich einzelliger RNA-Sequenzierung und einzelliger Proteomik – transformiert das Stamm-/Vorläuferzellfeld, indem es eine beispiellose Auflösung einzelner Zellexpressionsänderungen im Kontext populations- oder gewebeweiter Veränderungen ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir detaillierte Protokolle zur Sezieren von Mausepididymalfettgewebe bereit, isolieren einzelne Fettgewebe-abgeleitete Zellen und führen fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durch, um für lebensfähige Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs anzureichern. Diese Protokolle ermöglichen es den Forschern, hochwertige APCs vorzubereiten, die für nachgelagerte Analysen wie die sequenziumierende RNA-Sequenzierung einzelner Zellen geeignet sind.

In diesem Experiment wurden vier Monate alte männliche FVB-Mäuse verwendet. Nach dem Ausschluss von Schutt und Doublets mit FSC/SSC-Plots wurden lebensfähige Zellen (DAPI- Population) abgezäut, gefolgt von der Auswahl von APC+/FITC- Population (Abbildung 1). DAPI-, APC- und FITC-Gates wurden basierend auf der ungefärbten Steuerung gezeichnet. Gating-Strategien sind in Abbildung 1dargestellt.
Nach ...

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Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K Aufrufe.  Mayo Clinic. Wir präsentieren eine einfache Methode, um hochlebensfähige Fettvorläuferzellen von mausepididymalen Fettpolstern mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung zu isolieren.

Serie: Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type in white adipose tissue. Understanding how adipocytes function and respond to (epi)genetic and environmental signals is essential for identifying the cause(s) of obesity. RNA and chromatin have previously been isolated from adipocytes using enzymatic digestion. In addition, protocols have been developed for nuclear isolation, where purification is achieved by fluorescence-activated cell sorting (FACS) of adipocyte-specific transgenic reporters. One of the greatest challenges to achieving high yield and quality during such protocols is the substantial amount of lipid contained in adipose tissue. The present protocol describes an optimized procedure for isolating mature adipocytes that leverages heptane to separate lipids from the targets of interest (RNA/chromatin). The resulting RNA has high integrity and generates high-quality RNA-seq results. Likewise, the procedure improves nuclei yield rate and generates reproducible ChIP-seq results across samples. Therefore, the current study provides a reliable and universal murine adipocyte isolation protocol suitable for whole-genome transcriptome and epigenome studies.

The present protocol summarizes a universal method for isolating, purifying, and upstream processing of murine white adipocytes optimized for downstream total RNA sequencing, Nuclei Extraction by SONication (NEXSON), and ChIP-seq.

Obesity is a complex disease influenced by genetics, epigenetics, the environment, and their interactions. Mature adipocytes represent the major cell type ...

Genetik

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Immunologie und Infektion

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white preadipocyte cell lines. These cultured cell lines, however, have limitations. They do not fully capture the diverse functional spectrum of the heterogenous adipocyte populations that are now known to exist within white adipose depots. To provide a more physiologically relevant model to study the complexity of white adipose tissue, a protocol has been developed and optimized to enable simultaneous isolation of primary white and brown adipocyte progenitors from newborn mice, their rapid expansion in culture, and their differentiation in vitro into mature, fully functional adipocytes. The primary advantage of isolating primary cells from newborn, rather than adult mice, is that the adipose depots are actively developing and are, therefore, a rich source of proliferating preadipocytes. Primary preadipocytes isolated using this protocol differentiate rapidly upon reaching confluence and become fully mature in 4-5 days, a temporal window that accurately reflects the appearance of developed fat pads in newborn mice. Primary cultures prepared using this strategy can be expanded and studied with high reproducibility, making them suitable for genetic and phenotypic screens and enabling the study of the cell-autonomous adipocyte phenotypes of genetic mouse models. This protocol offers a simple, rapid, and inexpensive approach to study the complexity of adipose tissue in vitro.

This report describes a protocol for the simultaneous isolation of primary brown and white preadipocytes from newborn mice. Isolated cells can be grown in culture and induced to differentiate into fully mature white and brown adipocytes. The method enables genetic, molecular, and functional characterization of primary fat cells in culture.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

The understanding of the mechanisms underlying adipocyte differentiation and function has greatly benefited from the use of immortalized white ...

Biologie

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance contributes to the development of type 2 diabetes (T2D) and other obesity-derived diseases of high prevalence worldwide. Therefore, understanding the mechanisms underlying insulin resistance is of great relevance. Several models have been used to study insulin resistance both in vivo and in vitro; primary adipocytes represent an attractive option to study the mechanisms of insulin resistance and identify molecules that counteract this condition and the molecular targets of insulin-sensitizing drugs. Here, we have established an insulin resistance model using primary adipocytes in culture treated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;).
Adipocyte precursor cells (APCs), isolated from collagenase-digested mouse subcutaneous adipose tissue by magnetic cell separation technology, are differentiated into primary adipocytes. Insulin resistance is then induced by treatment with TNF-&#945;, a proinflammatory cytokine that reduces the tyrosine phosphorylation/activation of members of the insulin signaling cascade. Decreased phosphorylation of insulin receptor (IR), insulin receptor substrate (IRS-1), and protein kinase B (AKT) are quantified by western blot. This method provides an excellent tool to study the mechanisms mediating insulin resistance in adipose tissue.

This protocol describes the isolation of mouse preadipocytes from subcutaneous fat, their differentiation into mature adipocytes, and the induction of insulin resistance. Insulin action is evaluated by the phosphorylation/activation of members of the insulin signaling pathway through western blot. This method allows direct determination of insulin resistance/sensitivity in primary adipocytes.

Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Kultivierung von Präadipozyten, die aus perivaskulärem Fettgewebe der Maus isoliert wurden

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Autor im Rampenlicht: Die Bedeutung von Isolierung, Kultur und adipogener Induktion von SVF-abgeleiteten Präadipozyten aus perivaskulärem Fettgewebe der Maus 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Zusammenfassung

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Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Isolation and Processing of Murine White Adipocytes for Transcriptome and Epigenome Analyses

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus

Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von Präadipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion aus periaortischem Fettgewebe der Maus