Reconocemos el Centro de Citometría de Flujo de Flujo de Núcleo de Análisis celular microscopía de Mayo Clinic para obtener ayuda con la clasificación de FACS.

Todos los procedimientos experimentales con animales fueron realizados bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Preparación de soluciones 
<ol><li>Preparar solución de colágeno 2% (w/v) disolviendo la colágenasa II 2 g en la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hanks de 100 ml. Aliquot 200 μL cada uno para cada uso.</li>
	<li>Prepare el medio de neutralización mezclando 84 mL F-12 medio, 15 ml de suero de caballo y 1 mL de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Prepare el amortiguador de la citometría de flujo disolviendo 500 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y 400 μL de 0,5 M EDTA en 100 ml de solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS).</li>
</ol>2. Disección de la almohadilla de grasa epidímica y la disociación tisular
<ol><li>Eutanasia humana (dislocación isoflurano/cervical) un ratón macho. En este protocolo, se utilizó un ratón FVB de cuatro meses de antigüedad.</li>
	<li>Aplicar/rociar 70% etanol en el abdomen y exponer la cavidad abdominal inferior usando tijeras y fórceps limpios.</li>
	<li>Localice la almohadilla de grasa epidímica (proximal/unida a los testículos). Sostenga la unión entre los testículos y la almohadilla de grasa epididímica con fórceps contundentes y tire suavemente para liberar la almohadilla de grasa epididímica.</li>
	<li>Retire los testículos cortando con tijeras e incubar la almohadilla de grasa epidídmica en 5 ml de HBSS complementado con 3% BSA en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Centrífuga a 150 x g durante 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Tome almohadilla flotante de grasa epidímica del tubo cónico de 50 ml y mince finamente el tejido usando tijeras limpias.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de colágeno 2% en 3,8 ml de HBSS en un tubo de cultivo de 13 ml. Añadir el tejido picado e incubar en una incubadora giratoria a 5 rpm durante 1 h a 37 °C. En lugar de una incubadora giratoria, la incubadora de cultivo celular a 37 °C se puede utilizar alternativamente con agitaciones ocasionales.</li>
	<li>Transfiera contenido completo a un tubo cónico de 50 ml y añada 10 ml de medio de neutralización. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces.</li>
	<li>Prepare otro tubo cónico de 50 ml equipado con un colador de células de 70 μm. Filtre el tejido digerido en el nuevo tubo utilizando el colador celular.</li>
	<li>Transfiera el flujo a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 350 x g durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y los pellets celulares resuspend con 5 ml de DPBS. Centrífuga a 350 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 50 μL de tampón de citometría de flujo. Mezcle bien pipeteando suavemente y mantenga las células sobre hielo. Debido al volumen de los pellets celulares y la pequeña cantidad de sobrenadante residual, el volumen total de células en el búfer de citometría de flujo será mayor que 50 μL (aproximadamente 100 μL).</li>
</ol>3. Etiquetado de anticuerpos y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)
<ol><li>Después de mezclar bien las células con pipeteo suave, transfiera 54 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Agregue 6 μL de reactivo de bloqueo FcR y mezcle bien pipeteando suavemente. Incubar a 4 °C durante 10 min. Guarde las células sobrantes después de tomar 54 μL y guárdelas en el hielo para usarlas como control no manchado en los pasos 3.5 y 3.6.</li>
	<li>Durante la incubación en el paso 3.1, prepara un cóctel de anticuerpos combinando 11 μL cada uno de anticuerpos anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC y anticuerpos anti-CD45-FITC en un tubo de microcentrífuga. Mezcle bien con tuberías suaves y mantenga el hielo protegido de la luz.</li>
	<li>Después de la incubación con reactivo de bloqueo FcR durante 10 minutos, añadir 40 μL del cóctel de anticuerpos y mezclar bien mediante pipeteo suave. Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo complementado con 1 μg/ml de DAPI en las células manchadas. Mezcle bien con suaves células de pipeteo y filtro utilizando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga las células en el hielo.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de citometría de flujo a las células restantes en el paso 3.1 y mezclar bien mediante pipeteo suave. Filtre las células usando un tubo de ensayo de 5 ml con tapa de presión del colador celular. Mantenga estas células sobre hielo y utilícelas como control sin manchar en el siguiente paso.</li>
	<li>Lleve las células manchadas y el control sin manchar al instrumento de análisis o clasificación FACS.<ol>
<li>Identifique y aísle la población APC+/FITC-/DAPI- con las estrategias de gating mostradas en la Figura 1. Estas células representan células Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- viables. Los desechos y los agregados celulares se agotan utilizando gráficas de dispersión hacia delante (FSC) y laterales (SSC). A continuación, DAPI- población está cerrada, seguido de gating de APC+/FITC- población. Los controles no manchados deben utilizarse para ayudar a establecer parámetros de gating.</li>
		<li>Recoja las células en 500 μL de tampón de citometría de flujo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. En el futuro, todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles para minimizar una contaminación. Aproximadamente 50.000 – 100.000 células se recogen de un ratón.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuente las células usando un hemociclograma para evaluar la viabilidad celular. Dado que los agregados celulares pueden interferir con más análisis posteriores, la presencia de agregados celulares también se evalúa para garantizar una presencia mínima (<5% del número de células viables) de estos agregados.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) está ganando rápidamente tracción como una poderosa herramienta para estudiar simultáneamente diversas poblaciones celulares a nivel de una sola célula. Debido a los altos costos asociados con la preparación de muestras y la secuenciación de alto rendimiento, es imperativo optimizar las entradas celulares (alta viabilidad y pureza) para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Algunos protocolos de preparación celular se basan en la eliminación de ...

El tejido adiposo desempeña un papel clave en el metabolismo energético. El exceso de energía se almacena en forma de lípidos, y el tejido adiposo es capaz de expansión o retracción significativa dependiendo del estado nutricional y la demanda energética. La expansión del tejido adiposo puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de los adipocitos (hipertrofia) y/o de un aumento en el número de adipocitos (hiperplasia); este último proceso estrictamente regulado por la proliferación y diferenciación de las células progenitoras adiposas1,2. Durante la obesidad, el tejido adiposo se expande excesivamente, y la disfunción tisular – incluyendo hipoxia, inflamación y resistencia a la insulina – a menudo desarrolla3,4. Estas complicaciones son factores de riesgo para muchas enfermedades crónicas como hipertensión, diabetes, enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular y cáncer5. Por lo tanto, limitar la expansión incontrolada del tejido adiposo y mitigar las patologías del tejido adiposo son las principales prioridades de investigación biomédica. Durante la expansión del tejido adiposo, las células madre derivadas del tejido adiposo residentes (ASC) proliferan y diferencian secuencialmente en preadipocitos (células progenitoras comprometidas) y luego en adipocitos maduros6. Estudios recientes de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) muestran que estas poblaciones de células progenitoras adiposas (APC) (ASC y preadipocitos) exhiben heterogeneidad molecular y funcional sustancial7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, los ASC muestran una capacidad de diferenciación adipogénica reducida, al tiempo que exhiben mayores capacidades de proliferación y expansión, en comparación con los preadipocitos7. Se notifican nuevas diferencias moleculares en las poblaciones de ASC y preadipocitos, aunque la relevancia funcional de estas diferencias sigue sin estar clara7. Juntos, estos datos resaltan la complejidad del grupo de células progenitoras adiposas y subrayan la necesidad de desarrollar y estandarizar herramientas para comprender y manipular mejor estas poblaciones celulares críticas.
Este protocolo detalla el aislamiento de la alta viabilidad Sca1+ poblaciones de células progenitoras adiposas de almohadillas de grasa epidídmica del ratón que son adecuadas para análisis sensibles aguas abajo, incluyendo estudios unicelulares (secuenciación de SCRNA) y cultivo celular. El aislamiento y la disociación de las almohadillas de grasa epidídmica se realizaron como se describió anteriormente7,13 con ligeras modificaciones que mejoran la viabilidad de los APCs aislados. En resumen, las células disociadas de las almohadillas de grasa epidídmica están manchadas con anticuerpos contra Sca1, un marcador tanto para ASC como para preadipocitos6,7,y otros marcadores de linaje (Lin): Ter119 (células eritroides), CD31 (células endoteliales) y CD45 (leucocitos). Viable Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- las células se ordenan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Es importante destacar que este protocolo fue validado por el aislamiento y análisis exitosos de células progenitoras Sca1+/Linviables - adiposas notificadas en un estudio reciente de secuenciación de ARN de una sola célula que identificó subpoblaciones funcionalmente heterogéneas dentro de ASC y preadipocitos7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

La obesidad y los trastornos metabólicos como la diabetes, las enfermedades cardíacas y el cáncer están asociados con la remodelación dramática del tejido adiposo. Las células progenitoras adiposas residentes en tejidos (APC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido adiposo y pueden contribuir a la patología tisular. El creciente uso de tecnologías de análisis unicelular ,incluida la secuenciación de ARN unicelular y la proteómica unicelular, está transformando el campo celular madre/progenitor al permitir una resolución sin precedentes de los cambios en la expresión celular individual en el contexto de cambios en toda la población o en todo el tejido. En este artículo, proporcionamos protocolos detallados para diseccionar el tejido adiposo epidídmico del ratón, aislar células derivadas de tejido adiposo único y realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer para Sca1viable +/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. Estos protocolos permitirán a los investigadores preparar APCs de alta calidad adecuados para análisis posteriores, como la secuenciación de ARN de una sola célula.

En este experimento se utilizaron ratones FVB machos de cuatro meses de edad. Después de la exclusión de escombros y dobletes utilizando parcelas FSC/SSC, las células viables (DAPI- población) fueron cerradas, seguidas por la selección de APC+/FITC- población (Figura 1). Las puertas DAPI, APC y FITC se dibujaron sobre la base del control sin manchar. Las estrategias de Gating se muestran en la Figura 1.
<p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K vistas.  Mayo Clinic. Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Video: Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

Aislamiento Manual de células madre derivadas de tejido adiposo de Lipoaspirates Humanos

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Investigación

Biología

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identificación y disección de diversos depósitos de adipose de ratón

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Aislamiento e identificación de células endoteliales vasculares de distintos depósitos adiposos para aplicaciones posteriores

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Aislamiento y caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

Autor destacado: Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Cultivo de preadipocitos aislados de tejido adiposo perivascular murino

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Autor destacado: La importancia del aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de preadipocitos derivados de SVF a partir de tejido adiposo perivascular de ratón 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón