FACS sıralama konusunda yardım için Mayo Clinic Mikroskopi Hücre Analizi Çekirdek Akış Sitometri Tesisi'ni kabul ediyoruz.

Tüm hayvan deneysel işlemleri Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanarak gerçekleştirildi.
1. Çözelti hazırlama 
<ol><li>Kollajenaz II 2 g'ı 100 mL Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) çözerek kollajenaz% 2 (w/v) çözeltisi hazırlayın. Her kullanım için aliquot 200 μL her biri.</li>
	<li>84 mL F-12 orta, 15 mL at serumu ve 1 mL penisilin/streptomisisini karıştırarak nötralizasyon ortamını hazırlayın.</li>
	<li>Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininin (DPBS) 100 mL'sinde 500 mg sığır serum albümini (BSA) ve 400 μL 0,5 M EDTA'yı eriterek akış sitometri tamponu hazırlayın.</li>
</ol>2. Epididimal yağ yastığının diseksiyonu ve doku ayrışması
<ol><li>İnsanca ötenazi (izofluran/servikal çıkık) bir erkek fare. Bu protokolde dört aylık bir FVB fare kullanıldı.</li>
	<li>Karın bölgesine %70 etanol uygulayın/püskürtün ve temiz makas ve önps kullanarak alt karın boşluğunu ortaya çıkarın.</li>
	<li>Epididimal yağ yastığını bulun (proksimal/testislere bağlı). Testisler ve epididimal yağ pedi arasındaki kavşağı künt toparlamalarla tutun ve epididimal yağ yastığını serbest bırakmak için hafifçe çekin.</li>
	<li>Makas kullanarak keserek testisleri çıkarın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında 50 mL konik bir tüpte% 3 BSA ile desteklenmiş 5 mL HBSS'de epididimal yağ yastığını kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4 °C'de 7 dakika boyunca 150 x g'da santrifüj.</li>
	<li>50 mL konik tüpten yüzen epididimal yağ yastığı alın ve temiz makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kıyın.</li>
	<li>13 mL kültür tüpünde 3,8 mL HBSS'ye 200 μL kollajenaz% 2 çözelti ekleyin. Kıyılmış dokuyu ekleyin ve 37 °C'de 1 saat boyunca 5 rpm'de dönen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Dönen bir inkübatör yerine, 37 °C'deki hücre kültürü inkübatörü alternatif olarak zaman zaman ajitasyonlarla kullanılabilir.</li>
	<li>Tüm içeriği 50 mL konik bir tüpe aktarın ve 10 mL nötralizasyon ortamı ekleyin. Tüpü 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>70 μm hücre süzgeç ile donatılmış başka bir 50 mL konik tüp hazırlayın. Hücre süzgecini kullanarak sindirilen dokuyu yeni tüpe filtreleyin.</li>
	<li>Akışı 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da 15 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın.</li>
	<li>5 mL DPBS ile süpernatant ve resuspend hücre peletlerini dikkatlice çıkarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 350 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 50 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın ve hücreleri buzda tutun. Hücre peletlerinin hacmi ve az miktarda artık süpernatant nedeniyle, akış sitometri tamponundaki hücrelerin toplam hacmi 50 μL'den (yaklaşık 100 μL) büyük olacaktır.</li>
</ol>3. Antikor etiketleme ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)
<ol><li>Hücreleri nazik pipetleme ile iyice karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunun 54 μL'lik kısmını 1,7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 6 μL FcR blokaj reaktifi ekleyin ve hafifçe pipetleyarak iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır. 54 μL aldıktan sonra kalan hücreleri kaydedin ve 3.5 ve adım 3.6'da yersiz bir kontrol olarak kullanmak için buzda tutun.</li>
	<li>3.1. adımdaki inkübasyon sırasında, anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC ve anti-CD45-FITC antikorlarının her birini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir antikor kokteyli hazırlayın. Hafif pipetleme ile iyice karıştırın ve ışıktan korunan buz üzerinde tutun.</li>
	<li>FcR bloke reaktifi ile 10 dakika inkübasyondan sonra, antikor kokteylinin 40 μL'lik kısmını ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Lekeli hücrelere 1 μg/mL DAPI ile desteklenmiş 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin. Hücre süzgeç yapışma kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpü kullanarak nazik pipetleme ve filtre hücreleri ile iyice karıştırın. Hücreleri buzda tutun.</li>
	<li>3.1. adımda kalan hücrelere 500 μL akış sitometri tamponu ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. Hücre süzgeç yapıştırıcı kapaklı 5 mL test tüpü kullanarak hücreleri filtreleyin. Bu hücreleri buzda tutun ve aşağıdaki adımda bozulmamış bir kontrol olarak kullanın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri ve bozulmamış kontrolü FACS analiz veya sıralama cihazına götürün.<ol>
<li>Şekil 1'de gösterilen gating stratejileriyle APC+/FITC-/DAPI- popülasyonu tanımlayın ve yalıtın. Bu hücreler uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- hücrelerini temsil eder. Enkaz ve hücre agregaları ileri (FSC) ve yan dağılım (SSC) çizimleri kullanılarak tükenür. Daha sonra, DAPI- nüfus kapılı, ardından APC+/ FITC- nüfus gating. Gating parametrelerinin ayarlanmasına yardımcı olmak için ellenmemiş denetimler kullanılmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 500 μL akış sitometri tamponunda toplayın. İleriye doğru, kontaminasyonu en aza indirmek için tüm prosedürler steril koşullar altında yapılmalıdır. Bir fareden yaklaşık 50.000 – 100.000 hücre toplanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre canlılığını değerlendirmek için hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücre agregaları daha fazla aşağı akış analizini engelleyebileceğinden, hücre agregalarının varlığı da bu agregaların minimum varlığını (<5% uygulanabilir hücre sayısının) sağlamak için değerlendirilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution.">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li><li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+obesity+in+man:+cellular+character+of+the+adipose+tissue.">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li><li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue.">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li><li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+as+a+Disease.">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li><li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment:+going+back+to+the+future.">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li><li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling.">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li><li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues.">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li><li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells.">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li><li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples.">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219 (2020).</li><li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice.">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057 (2018).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair.">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li><li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects.">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), tek hücre düzeyindeki çeşitli hücre popülasyonlarını aynı anda incelemek için güçlü bir araç olarak hızla çekiş kazanıyor. Numune hazırlama ve yüksek verim sıralaması ile ilişkili yüksek maliyetler nedeniyle, deneysel başarı olasılığını artırmak için hücresel girdileri (yüksek canlılık ve saflık) optimize etmek zorunludur. Bazı hücre hazırlama protokolleri, FACS sıralama14olmadan düşük dönüşlü yıkamalar ve sü...

Yağ dokusu enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Fazla enerji lipitler şeklinde depolanır ve yağ dokusu beslenme durumuna ve enerjik talebe bağlı olarak önemli genişleme veya geri çekilme yeteneğine sahiptir. Yağ dokusunun genişlemesi adiposit boyutundaki (hipertrofi) ve/veya adiposit sayısındaki (hiperplazi) artıştan; ikinci süreç, yağ progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması ile sıkı bir şekilde düzenlenir1,2. Obezite sırasında, yağ dokusu aşırı genişler ve hipoksi, iltihaplanma ve insülin direnci de dahil olmak üzere doku disfonksiyonu genellikle3,4gelişir. Bu komplikasyonlar hipertansiyon, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, inme ve kanser dahil olmak üzere birçok kronik hastalık için risk faktörleridir5. Bu nedenle, kontrolsüz yağ dokusu genişlemesini sınırlamak ve yağ dokusu patolojilerini azaltmak en önemli biyomedikal araştırma öncelikleridir. Yağ dokusu genişlemesi sırasında, yerleşik yağ dokusundan türetilmiş kök hücreler (ASC'ler) çoğalır ve sırayla preadipositlere (taahhüt edilen progenitör hücreler) ve daha sonra olgun adipositlere farklılaşır6. Son tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) çalışmaları, bu yağ progenitör hücre (APC) popülasyonlarının (ASC'ler ve preadipositler) önemli moleküler ve fonksiyonel heterojenlik 7,8 ,9,10,11,12. Örneğin, ASC'ler daha az adipojenik farklılaşma kapasitesi gösterirken, preadipositler7'yekıyasla daha yüksek çoğalma ve genişletme yetenekleri de sergiler. ASC ve preadiposit popülasyonlarında daha fazla moleküler farklılıklar bildirilmektedir, ancak bu farklılıkların işlevsel ilgisi belirsizliğini korumaktadır7. Birlikte, bu veriler yağ progenitor hücre havuzunun karmaşıklığını vurgular ve bu kritik hücre popülasyonlarını daha iyi anlamak ve manipüle etmek için araçlar geliştirme ve standartlaştırma ihtiyacının altını çizer.
Bu protokol, tek hücreli çalışmalar (scRNA-dizileme) ve hücre kültürü de dahil olmak üzere hassas aşağı akış analizleri için uygun olan fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek canlılık Sca1+ yağ progenitör hücre popülasyonlarının izolasyonunun ayrıntılarını içerir. Epididimal yağ pedlerinin izolasyonu ve ayrışması, izole APC'lerin uygulanabilirliğini artıran hafif değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi7,13 olarak gerçekleştirildi. Kısacası, epididimal yağ pedlerinden ayrışmış hücreler, hem ASC'ler hem de preadipositler6,7ve diğer soy (Lin) belirteçleri için bir belirteçolanSca1'e karşı antikorlarla lekelenir: Ter119 (eritroid hücreler), CD31 (endotel hücreleri) ve CD45 (lökositler). Uygulanabilir Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- hücreler daha sonra floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile sıralanır. Daha da önemlisi, bu protokol, ASC'ler ve preadipositler içinde fonksiyonel olarak heterojen subpopulasyonları tanımlayan yeni bir tek hücreli RNA dizileme çalışmasında bildirilen uygulanabilir Sca1+/ Lin- yağ progenitör hücrelerinin başarılı izolasyonu ve analizi ile doğrulanmıştır7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:799px;" width="799">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:181px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-294</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">13 mL culture tube</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-809-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">188 271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">5 mL test tube with cell strainer snap cap</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:181px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">227 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">70 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD31-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-CD45-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Sca1-APC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-102-833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Anti-Ter119-FITC antibody</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-112-908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">BSA</td>
			<td style="width:181px;">Gold Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">A-420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Collagenase type II</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17101-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">DAPI</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">F-12 medium</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FcR blocking reagent</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Hanks&#39; balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Horse serum</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:181px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues

Obezite ve diyabet, kalp hastalığı ve kanser gibi metabolik bozuklukların tümü dramatik yağ dokusu tadilatı ile ilişkilidir. Doku bazlı yağ progenitör hücreler (APC' ler) yağ dokusu homeostazında önemli bir rol oynar ve doku patolojisine katkıda bulunabilir. Tek hücreli RNA dizilimi ve tek hücreli proteomik dahil olmak üzere tek hücreli analiz teknolojilerinin artan kullanımı, popülasyon veya doku çapındaki değişiklikler bağlamında bireysel hücre ifade değişikliklerinin benzeri görülmemiş bir şekilde çözülmesine izin vererek kök/progenitör hücre alanını dönüştürmektedir. Bu yazıda, fare epidimal yağ dokusunu parçalamak, tek yağ dokusundan türetilmiş hücreleri izole etmek ve uygulanabilir Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APC'ler için zenginleştirmek için floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Bu protokoller, araştırmacıların tek hücreli RNA dizilimi gibi aşağı akış analizleri için uygun yüksek kaliteli APC'ler hazırlamalarını sağlayacaktır.

Bu deneyde dört aylık erkek FVB fareleri kullanıldı. FSC/SSC arazileri kullanılarak enkaz ve çiftlerin dışlanmasından sonra, uygulanabilir hücreler (DAPI- popülasyon) kapılıydı, ardından APC+/ FITC- popülasyon seçimi (Şekil 1). DAPI, APC ve FITC kapıları, tespit edilmemiş kontrole göre çizildi. Gating stratejileri Şekil 1'de gösterilmiştir.
1 saat sıralamadan sonra, izolasyon...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues at JoVE.com

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Fare Epidididimal Yağ Dokularından Yağ Progenitör Hücrelerinin Hazırlanması

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K Görüntüleme.  Mayo Clinic. Floresan aktif hücre sıralamasını kullanarak fare epidididimal yağ pedlerinden yüksek oranda uygulanabilir yağ progenitör hücrelerini izole etmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Video: Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Biyoloji

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

İnsan aort Perivasküler yağ progenitör hücre farklılaşması kapasitesi

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Çeşitli fare Adipose depoları tanımlama ve diseksiyon

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Isolation and Identification of Vascular Endothelial Cells from Distinct Adipose Depots for Downstream Applications

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone regulation, barrier functions, and angiogenesis. Endothelial cell dysfunction is a hallmark predictor and major driver for the progression of severe cardiovascular diseases, yet the underlying mechanisms remain poorly understood. The ability to isolate and perform analyses on endothelial cells from various vascular beds in their native form will give insight into the processes of cardiovascular disease. This protocol presents the procedure for the dissection of mouse subcutaneous and mesenteric adipose tissues, followed by isolation of their respective arterial vasculature. The isolated arteries are then digested using a specific cocktail of digestive enzymes focused on liberating functionally viable endothelial cells. The digested tissue is assessed by flow cytometry analysis using CD31+/CD45&#8722; cells as markers for positive endothelial cell identification. Cells can be sorted for immediate downstream functional assays or used to generate primary cell lines. The technique of isolating and digesting arteries from different vascular beds will provide options for researchers to evaluate freshly isolated vascular cells&#160;from arteries of interest and allow them to perform a wide range of functional tests on specific cell types.

This protocol details a method for the dissection of mouse adipose depots and the isolation and digestion of respective arteries to liberate and then identify the endothelial cell population. Freshly isolated cells used in downstream applications will advance the understanding of vascular cell biology and the mechanisms of vascular dysfunction.

Vasküler Endotel Hücrelerinin Aşağı Akış Uygulamaları için Farklı Yağ Depolarından İzolasyonu ve Tanımlanması

Vascular endothelial cells lining the wall of the vascular system play important roles in a variety of physiological processes, including vascular tone ...

Yağ Dokusu Kaynaklı Kök Hücre İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in addition to their great capacity for self-renewal, migration, and proliferation. Adipose tissue is one of the least invasive and most accessible sources of mesenchymal cells. It has also been reported to have higher yields compared to other sources, as well as superior immunomodulatory properties. Recently, different procedures for obtaining adult mesenchymal cells from different tissue sources and animal species have been published. After evaluating the criteria of some authors, we standardized a methodology that is applicable to different purposes and easily reproducible. A pool of stromal vascular fraction (SVF) from perirenal and epididymal adipose tissue allowed us to develop primary cultures with optimal morphology and functionality. The cells were observed adhered to the plastic surface for 24 h, and exhibited a fibroblast-like morphology, with prolongations and a tendency to form colonies. Flow cytometry (FC) and immunofluorescence (IF) techniques were used to assess the expression of the membrane markers CD105, CD9, CD63, CD31, and CD34. The ability of adipose-derived stem cells (ASCs) to differentiate into the adipogenic lineage was also assessed using a cocktail of factors (4 &#181;M insulin, 0.5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine, and 1 &#181;M dexamethasone). After 48 h, a gradual loss of fibroblastoid morphology was observed, and at 12 days, the presence of lipid droplets positive to oil red staining was confirmed. In summary, a procedure is proposed to obtain optimal and functional ASC cultures for application in regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Türetilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması  

This protocol describes a methodology for isolating and identifying adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) from Sprague Dawley rats.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Murin Perivasküler Yağ Dokusundan İzole Edilen Preadipositlerin Kültürlenmesi

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue

Perivascular adipose tissue (PVAT) is an adipose tissue depot that surrounds blood vessels and exhibits the phenotypes of white, beige, and brown adipocytes. Recent discoveries have shed light on the central role of PVAT in regulating vascular homeostasis and participating in the pathogenesis of cardiovascular diseases. A comprehensive understanding of PVAT properties and regulation is of great importance for the development of future therapies. Primary cultures of periaortic adipocytes are valuable for studying PVAT function and the crosstalk between periaortic adipocytes and vascular cells. This paper presents an economical and feasible protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, which can be useful for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro. The protocol outlines tissue processing and cell differentiation for culturing periaortic adipocytes from young mice. This protocol will provide the technological cornerstone at the bench side for the investigation of PVAT function.

Yazar Spotlight: Fare Perivasküler Yağ Dokusundan SVF'den Türetilmiş Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonunun Önemi 

Here, we describe the isolation, culture, and adipogenic induction of stromal vascular fraction-derived preadipocytes from mouse periaortic adipose tissue, allowing for the study of perivascular adipose tissue function and its relationship with vascular cells.