Las mediciones cuantitativas precisas de las proteínas son cruciales para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas para comprender la enfermedad de vuelta a la biología. El objetivo general de este experimento es proporcionar un flujo de trabajo proteómico cuantitativo integrado para muestras de tejido, combinando perfiles de proteínas sin etiquetas y basados en etiquetas para el descubrimiento de biomarcadores. En este estudio, hemos utilizado el instrumento Orbitrap Fusion para cuantificar las proteínas utilizando enfoques basados en etiquetas y sin etiquetas.
La lisis tisular es uno de los pasos más cruciales para el éxito de un experimento LC-MS-MS. Tome 30 mg de tejido en un tubo de batido de cuentas. Después del lavado con el PBS, agregue 300 microlitros de tampón de lisis de urea que contenga ocho urea molar, Tris, NaCl y MgCl2.
Usando un sonicador de sonda, lise el contenido del tejido. Repita esto para otro ciclo. Si observa algún tejido intacto en la parte inferior del tubo, agregue perlas de circonio al tubo y homogeneice el tejido con un batidor de cuentas durante 90 segundos, con cinco minutos de incubación en hielo.
Centrifugar las muestras alrededor de 6000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para separar los restos celulares del sobrenadante. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco y mezcle la solución uniformemente. Cuantificar la concentración de proteínas en el lisato tisular utilizando el reactivo Bradford.
Para ello, mida el OD de la muestra a 595 nanómetros y extrapolíelo utilizando un gráfico estándar como se muestra en esta pantalla. Después de la cuantificación de proteínas, ejecute 10 microgramos de lisato tisular en gel 12% SDS-PAGE para verificar la calidad de los lisatos. El primer paso en la digestión en solución implica la reducción de los enlaces disulfuro, utilizando TCEP.
Después de la adición de TCEP, incube el contenido del tubo durante una hora a 37 grados centígrados. El siguiente paso consiste en la alquilación para evitar que los enlaces disulfuro reducidos se vuelvan a formar. Agregue un agente alquilante como la yodoacetamida e incube el tubo en la oscuridad durante 10 minutos.
Después de la incubación, reduzca la concentración final de urea a menos de un molar diluyendo con cuatro a ocho volúmenes de tampón de dilución. En este punto, es recomendable comprobar el pH. El siguiente paso implica la adición de tripsina al tubo y la incubación del tubo durante la noche para una digestión eficiente.
Al día siguiente, seque los péptidos digeridos en un concentrador de vacío y proceda al paso de desalinación. Para realizar la desalinación de péptidos, use puntas de etapa C18. Active la punta de la etapa C18 agregando 50 microlitros de metanol, centrífuga la punta a 1000 G durante dos minutos.
Ahora, agregue 50 microlitros de acetonitrilo en ácido fórmico al 0.1% para lavar la punta del escenario y, nuevamente, centrífuga la punta. Reconstituir los péptidos digeridos secos en 50 microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Agregue los péptidos reconstituidos en la punta de la etapa activada.
Repita este paso al menos cuatro veces. Para lavar la muestra, agregue 50 microlitros de ácido fórmico al 0,1% y repita el paso de centrifugación. Para la elución de péptidos, agregue 50 microlitros de 40% ACN en ácido fórmico al 0.1% y páselo a través de la punta de la etapa por centrifugación.
Repita este paso con 50% y 60% de ACN en ácido fórmico al 0,1% y recoja el filtrado en un tubo fresco. Seque los péptidos desalados con un concentrador de vacío. Antes de ejecutar LC-MS-MS, cuantifique los péptidos utilizando el método Scopes.
Para esto, cargue dos microlitros de muestra reconstituida en el pozo de una placa de microgotas, y mida la absorbancia a 205 nanómetros y 280 nanómetros. Calcule la concentración a partir de la fórmula descrita en esta diapositiva. Una vez que los péptidos desalados se secan, están listos para la cuantificación basada en etiquetas.
Para el etiquetado iTRAQ, los péptidos secos deben reconstituirse en 20 microlitros de tampón de disolución, proporcionados en el kit de etiquetado iTRAQ. Reconstituya las etiquetas agregando etanol del vial proporcionado en el kit y mezcle bien. Es aconsejable que todos los pasos se lleven a cabo según las instrucciones del fabricante.
Agregue las etiquetas iTRAQ mezcladas homogéneamente a sus respectivos tubos y permita que se produzca la reacción de etiquetado. Al final de la reacción, sucle cualquier exceso de etiqueta sin encuadernar en el tubo agregando agua de grado MS e incube durante media hora a una hora. Ahora, transfiera todo el contenido etiquetado en un solo tubo y seque los péptidos etiquetados.
Después de reconstituir las muestras en ácido fórmico al 0,1%, abra el muestreador automático de NanoLC y coloque las muestras dentro del muestreador automático. Una vez que las muestras se han colocado en el muestreador automático, es importante establecer los parámetros correctos para la cromatografía líquida y la espectrometría de masas. Aquí, describimos los parámetros tanto para la cuantificación sin etiquetas como para la cuantificación basada en iTRAQ utilizando LC-MS.
En caso de cuantificación sin etiqueta, se ha utilizado un gradiente de 120 minutos mientras se inyecta una sola muestra no fraccionada. Esta duración se puede aumentar o disminuir en función de la complejidad de la muestra. En este experimento, se ha establecido un flujo de 300 nanolitros por minuto con el siguiente gradiente para la solución B, que es 80% acetonitrilo en ácido fórmico al 1%, en este caso.
De la misma manera, podemos establecer un gradiente para un experimento iTRAQ. Dado que las muestras no están infraccionadas, se ha utilizado un gradiente de 90 minutos. Los parámetros de MS tanto para la cuantificación sin etiquetas, como para la cuantificación basada en etiquetas iTRAQ, se pueden ver aquí.
El primer paso consiste en configurar el modo de aplicación haciendo clic en los parámetros globales. Seleccione el modo de péptido y establezca la duración del método según el gradiente LC que se está utilizando. Defina los parámetros de análisis para el experimento.
Al hacer clic en la opción MS-OT, los parámetros se vuelven visibles. El tipo de detector en uso se establece en Orbitrap. La otra opción disponible en este instrumento incluye una trampa de iones.
La resolución se ha establecido en 60, 000, y se puede elegir entre diferentes opciones disponibles, dependiendo de la necesidad y el tipo de experimento. El rango de masa es normal y el rango de escaneo se establece de 375 a 1700. Los otros parámetros son predeterminados para MS Application.
Se ha establecido el umbral de intensidad y el estado de carga establecido en el rango de dos a seis. La exclusión dinámica se ha establecido en 40 segundos y la tolerancia de masa se ha mantenido en 10. El siguiente conjunto de parámetros incluye los parámetros MS-MS.
El modo de aislamiento se ha seleccionado con cuadrupolo, la ventana de aislamiento se ha establecido en dos, el desplazamiento de aislamiento se ha desactivado y el tipo de activación suele ser HCD para el experimento de proteómica. La energía de colisión puede ser fija o puede ser asistida. Las muestras etiquetadas requieren energías de colisión más altas, por lo tanto, para los experimentos iTRAQ, es aconsejable que la energía de colisión se establezca en 35, mientras que para los experimentos LFQ, se puede establecer en 30.
El tipo de detector utilizado aquí es Orbitrap. El modo de rango de escaneo será automático. Los otros parámetros son predeterminados para los experimentos iTRAQ y el experimento cuantitativo sin etiquetas.
Al hacer clic en el resumen, se obtendrá una visión general de todos los parámetros LC y MS utilizados para el experimento. Puede echar un vistazo a todos y cada uno de los parámetros y hacer la revisión. Una vez hecho esto, haga clic en el archivo y guárdelo como un archivo de método.
Una vez que guarde, puede ejecutar el método y obtendrá los archivos sin procesar. Y luego esos archivos sin procesar se pueden analizar utilizando el software Proteome Discoverer. Esta figura muestra la cobertura de secuencia de BSA en tres réplicas técnicas, que es del 91% en las tres réplicas.
Esto indica la reproducibilidad del instrumento. Ahora, esta figura muestra la uniformidad en el número de coincidencias espectrales de péptidos, péptidos y proteínas identificadas en tres muestras biológicas diferentes, lo que, nuevamente, da una idea sobre la reproducibilidad del instrumento. Aquí, el diagrama de Venn representa las proteínas comunes y exclusivas identificadas en tres muestras diferentes en el experimento sin etiqueta y el experimento basado en etiquetas.
Estos gráficos de barras muestran el número de coincidencias espectrales de péptidos, grupos peptídicos, proteínas totales, grupos de proteínas y número de proteínas después del 1% de FDR, identificados en el experimento LFQ e iTRAQ. La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles.
El uso de réplicas técnicas garantiza una buena reproducibilidad, incluso si las muestras se ejecutan en diferentes puntos de tiempo. Aquí, hemos mostrado el análisis de muestras de tejido utilizando dos métodos de cuantificación: proteómica sin etiquetas y basada en etiquetas. La selección de las técnicas proteómicas cuantitativas puede depender del número de muestras, la disponibilidad de plataformas de EM y la cuestión biológica que se abordará.
