Точные количественные измерения белков имеют решающее значение для понимания динамического и пространственного сотрудничества между белками, чтобы понять болезнь обратно в биологию. Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы обеспечить интегрированный рабочий процесс количественной протеомики для образцов тканей, сочетая профилирование белка без этикеток и на основе этикеток для обнаружения биомаркеров. В этом исследовании мы использовали инструмент Orbitrap Fusion для количественной оценки белков с использованием подходов на основе этикеток и без этикеток.
Лизис тканей является одним из наиболее важных шагов для успеха эксперимента LC-MS-MS. Возьмите 30 мг ткани в бисерной пробирке. После промывки PBS добавьте 300 микролитр буфера лизиса мочевины, содержащего восемь молярных мочевин, Tris, NaCl и MgCl2.
С помощью зондового ультразвукового аппарата различаем содержимое ткани. Повторите это для другого цикла. Если вы наблюдаете какую-либо неповрежденную ткань на дне трубки, добавьте шарики циркония в трубку и гомогенизируйте ткань с помощью бисерного взбивателя в течение 90 секунд, с пятиминутной инкубацией на льду.
Центрифугировать образцы около 6000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить клеточный мусор от супернатанта. Соберите супернатант в свежую пробирку и равномерно перемешайте раствор. Количественно оцените концентрацию белка в тканевом лизате с помощью реагента Брэдфорда.
Для этого измерьте OD образца на уровне 595 нанометров и экстраполируете его с помощью стандартного графика, как показано на этом экране. После количественной оценки белка запустите 10 микрограмм тканевого лизата на 12% геля SDS-PAGE, чтобы проверить качество лизатов. Первый этап в переваривании в растворе включает восстановление дисульфидных связей с использованием TCEP.
После добавления TCEP инкубируют содержимое трубки в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Следующий этап включает алкилирование для предотвращения повторного образования восстановленных дисульфидных связей. Добавьте алкилирующий агент, такой как йодоацетамид, и инкубируют трубку в темноте в течение 10 минут.
После инкубации снижают конечную концентрацию мочевины до менее чем одного моляра путем разбавления четырьмя-восемью объемами буфера разбавления. В этот момент желательно проверить рН. Следующий шаг включает в себя добавление трипсина в трубку и инкубирование трубки в течение ночи для эффективного пищеварения.
На следующий день высушите переваренные пептиды в вакуумном концентраторе и приступайте к этапу обессоливания. Для выполнения обессоливания пептидов используйте наконечники стадии C18. Активируйте наконечник ступени C18, добавив 50 микролитров метанола, центрифугируйте наконечник при 1000 G в течение двух минут.
Теперь добавьте 50 микролитров ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты, чтобы промыть кончик стадии, и снова центрифугировать наконечник. Восстановить высушенные переваренные пептиды в 50 микролитрах 0,1% муравьиной кислоты. Добавьте восстановленные пептиды в активированный наконечник стадии.
Повторите этот шаг не менее четырех раз. Чтобы промыть образец, добавьте 50 микролитр 0,1% муравьиной кислоты и повторите этап центрифугирования. Для элюирования пептидов добавляют 50 микролитров 40% ACN в 0,1% муравьиной кислоты и пропускают его через кончик стадии путем центрифугирования.
Повторите этот шаг с 50% и 60% ACN в 0,1% муравьиной кислоты и соберите фильтрат в свежую трубку. Высушите обессоливые пептиды с помощью вакуумного концентратора. Перед запуском LC-MS-MS количественно оцените пептиды с помощью метода Scopes.
Для этого загрузите два микролитра восстановленного образца в скважину микрокадровой пластины и измерьте поглощение на 205 нанометров и 280 нанометров. Рассчитайте концентрацию по формуле, описанной на этом слайде. Как только обессоленные пептиды высушены, они готовы к количественной оценке на основе этикеток.
Для маркировки iTRAQ высушенные пептиды должны быть восстановлены в 20 микролитрах буфера растворения, поставляемого в комплекте маркировки iTRAQ. Восстанавливайте этикетки, добавляя этанол из флакона, поставляемого в наборе, и тщательно перемешайте. Желательно, чтобы все этапы были выполнены в соответствии с инструкциями производителя.
Добавьте однородно смешанные этикетки iTRAQ к соответствующим пробиркам и обеспечьте реакцию маркировки. В конце реакции закалите любую лишнюю несвязанный этикетку в пробирке, добавив воду ms-класса, и инкубируете в течение получаса до одного часа. Теперь переложите все меченое содержимое в одну пробирку и высушите меченые пептиды.
После воссоздания образцов в 0,1% муравьиной кислоты откройте автосамплер NanoLC и поместите образцы внутрь автосамплера. После того, как образцы были помещены в автопробоотборщик, важно установить правильные параметры для жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Здесь мы опишем параметры как для количественного определения без меток, так и для количественного определения на основе iTRAQ с использованием LC-MS.
В случае количественного определения без меток используется 120-минутный градиент в качестве одного нефракционированного образца. Эта продолжительность может быть увеличена или уменьшена в зависимости от сложности образца. В этом эксперименте был установлен поток 300 нанолитров в минуту со следующим градиентом для раствора B, который в данном случае составляет 80% ацетонитрила в 1% муравьиной кислоты.
Таким же образом мы можем задать градиент для эксперимента iTRAQ. Поскольку образцы не являются нарушениями, используется 90-минутный градиент. Параметры MS как для количественной оценки без меток, так и для количественной оценки на основе меток iTRAQ можно увидеть здесь.
Первый шаг включает в себя настройку режима приложения путем нажатия на глобальные параметры. Выберите пептидный режим и задайте продолжительность метода в соответствии с используемым градиентом LC. Определите параметры сканирования для эксперимента.
При нажатии на опцию MS-OT параметры становятся видимыми. Тип детектора установлен в Orbitrap. Другая опция, доступная на этом инструменте, включает в себя ионную ловушку.
Разрешение было установлено на 60 000, и можно выбрать между различными доступными вариантами, в зависимости от необходимости и типа эксперимента. Диапазон масс нормальный, а диапазон сканирования установлен от 375 до 1700. Остальные параметры по умолчанию для MS Application.
Порог интенсивности установлен, а состояние заряда установлено в диапазоне от двух до шести. Динамическое исключение установлено на 40 секунд, а допуск по массе сохранен на 10. Следующий набор параметров включает параметры MS-MS.
Режим изоляции был выбран с квадруполем, окно изоляции установлено на два, смещение изоляции было отключено, а тип активации обычно HCD для эксперимента по протеомике. Энергия столкновения может быть либо зафиксирована, либо ей можно помочь. Меченые образцы требуют более высоких энергий столкновения, поэтому для экспериментов iTRAQ желательно, чтобы энергия столкновения была установлена на 35, в то время как для экспериментов LFQ она может быть установлена на 30.
Тип детектора, используемый здесь, - Orbitrap. Режим диапазона сканирования будет автоматическим. Остальные параметры по умолчанию для экспериментов iTRAQ и количественного эксперимента без меток.
При нажатии на сводку будет представлен обзор всех параметров LC и MS, используемых для эксперимента. Вы можете посмотреть на каждый параметр и выполнить корректуру. Как только это будет сделано, нажмите на файл и сохраните его как файл метода.
После сохранения вы можете запустить метод, и вы получите необработанные файлы. И тогда эти необработанные файлы могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer. На этом рисунке показано покрытие последовательности BSA в трех технических репликах, что составляет 91% в трех репликах.
Это свидетельствует о воспроизводимости документа. Теперь этот рисунок показывает однородность в количестве пептидных спектральных совпадений, пептидов и белков, идентифицированных в трех разных биологических образцах, что, опять же, дает представление о воспроизводимости инструмента. Здесь диаграмма Венна представляет общие и эксклюзивные белки, идентифицированные в трех различных образцах в эксперименте без этикеток и эксперименте на основе этикеток.
Эти гистограммы показывают количество пептидных спектральных совпадений, пептидных групп, общих белков, белковых групп и белкового числа после 1% FDR, идентифицированных в эксперименте LFQ и iTRAQ. Тканевая протеомика биологических образцов позволяет исследовать новые потенциальные биомаркеры, связанные с различными стадиями прогрессирования заболевания. Описанный протокол количественного протеомного анализа тканей обеспечивает воспроизводимые хорошие данные покрытия.
Использование технических реплик обеспечивает хорошую воспроизводимость, даже если образцы выполняются в разные моменты времени. Здесь мы показали анализ образцов тканей с использованием двух методов количественного определения: протеомики без меток и протеомики на основе этикеток. Выбор количественных протеомных методов может зависеть от количества образцов, наличия MS-платформ и биологического вопроса, который необходимо решить.
