タンパク質の正確な定量的測定は、生物学に戻って病気を理解するためにタンパク質間の動的かつ空間的な協力を理解するために重要です。この実験の全体的な目的は、バイオマーカー発見のためのラベルフリーおよびラベルベースのタンパク質プロファイリングを組み合わせた、組織サンプルの統合された定量プロテオミクスワークフローを提供することです。本研究では、標識ベースの標識のないアプローチを用いてタンパク質を定量化するために、オービットラップ・フュージョンという計器を用いた。
組織のリシスは、LC-MS-MS実験を成功させる最も重要なステップの1つです。ビーズの鼓動管に30mgの組織を取る。PBSで洗浄した後、8つの大臼歯、トリス、NaClおよびMgCl2を含む尿素溶菌緩衝液の300マイクロリットルを加える。
プローブ超音波処理器を使用して、組織の内容物を解凍します。別のサイクルに対してこれを繰り返します。チューブの底に無傷の組織を観察した場合は、チューブにジルコニウムビーズを加え、ビーズビーターを使用して90秒間、氷の上に5分間インキュベーションして組織を均質化します。
サンプルを摂氏4度で15分間遠心分離し、上清から細胞の破片を分離します。新鮮なチューブに上清を収集し、均一に溶液を混合します。ブラッドフォード試薬を用いて組織ライセート中のタンパク質濃度を定量化する。
この場合、サンプルのODを595ナノメートルで測定し、この画面に示すように標準グラフを使用して推定します。タンパク質定量に続いて、12%SDS-PAGEゲルで10マイクログラムの組織ライセートを実行し、ライセートの品質を確認します。インソリューション消化の最初のステップは、TCEPを使用して、ジスルフィド結合の減少を含みます。
TCEPの添加に続いて、37°Cで1時間チューブの内容物をインキュベートします。次のステップは、還元された二硫化結合の再形成を防ぐためにアルキル化を伴う。ヨウドアセトアミドのようなアルキル化剤を添加し、チューブを暗く10分間インキュベートします。
インキュベーション後、4~8体積の希釈バッファーで希釈することにより、尿素の最終濃度を1モル未満に下げます。この時点で、pHを確認することをお勧めします。次のステップは、トリプシンをチューブに加え、効率的な消化のためにチューブを一晩インキュベートすることを含む。
翌日、消化したペプチドを真空濃縮器で乾燥させ、脱塩工程に進みます。ペプチドの脱塩を行うために、C18段階のヒントを使用してください。50マイクロリットルのメタノールを加えてC18段先端を活性化し、1000Gで先端を2分間遠心分離する。
今度は、0.1%のギ酸に50マイクロリットルのアセトニトリルを加えてステージ先端を洗浄し、再び先端を遠心分離する。乾燥した消化されたペプチドを0.1%のギ酸の50マイクロリットルで再構成する。活性化された段階の先端に再構成されたペプチドを加える。
この手順を少なくとも 4 回繰り返します。試料を洗浄するには、0.1%のギ酸を50マイクロリットル加え、遠心分離工程を繰り返します。ペプチドの溶出のために、0.1%のギ酸に40%ACNの50マイクロリットルを加え、遠心分離によって段階先端を通過する。
0.1%のギ酸で50%と60%ACNでこのステップを繰り返し、新鮮なチューブに濾液を集める。脱塩したペプチドを真空濃縮器で乾燥させます。LC-MS-MSの実行に先立ち、Scopes法を用いてペプチドを定量化してください。
このために、再構成したサンプルを2マイクロリットルのマイクロドロッププレートのウェルに積み込み、205ナノメートルと280ナノメートルで吸光度を測定します。このスライドで説明した式から濃度を計算します。脱塩ペプチドは、いったん乾燥すると、ラベルベースの定量化の準備が整います。
iTRAQ標識の場合、乾燥したペプチドは、iTRAQ標識キットに用意されている20マイクロリットルの溶解バッファーで再構成されなければならない。キットに付属のバイアルからエタノールを添加してラベルを再構成し、十分に混ぜ合わせます。すべての手順は、製造元の指示に従って実行することをお勧めします。
均質に混合されたiTRAQラベルをそれぞれのチューブに加え、標識反応を起こすのを可能にします。反応の最後に、MSグレードの水を加えることによってチューブ内の余分な非結合標識をクエンチし、30分から1時間インキュベートする。次に、標識された内容物をすべて単一のチューブに移し、標識されたペプチドを乾燥させます。
サンプルを0.1%のギク酸に再構成した後、NanoLCのオートサンプラーを開き、オートサンプラーの内部にサンプルを置きます。サンプルをオートサンプラーに入れたら、液体クロマトグラフィーと質量分析の適切なパラメータを設定することが重要です。ここでは、LC-MS を使用したラベルなし定量と iTRAQ ベースの定量の両方のパラメータについて説明します。
ラベルなしの定量の場合、120分の勾配が単一の未分離れたサンプルとして注入されている。この期間は、サンプルの複雑さに基づいて増減できます。この実験では、溶液Bの流れを1%ギ酸中80%のアセトニトリルである溶液Bに対して、300ナノリットルの流れを設定した。
同様に、iTRAQ実験の勾配を設定することができます。サンプルが分画されていないので、90分の勾配が使用されています。ラベルフリー定量と iTRAQ ベースの定量の両方の MS パラメータをここで確認できます。
最初の手順では、グローバル パラメータをクリックしてアプリケーション モードを設定します。ペプチドモードを選択し、使用するLC勾配に従って方法の持続時間を設定します。実験のスキャン パラメータを定義します。
MS-OT オプションをクリックすると、パラメータが表示されます。使用中の検出器タイプはオービットラップに設定されています。この機器で使用できる他のオプションには、イオントラップが含まれています。
解像度は 60,000 に設定されており、実験の必要性と種類に応じて、使用可能なさまざまなオプションを選択できます。質量範囲は正規であり、スキャン範囲は375から1700に設定されます。その他のパラメータは MS アプリケーションのデフォルトです。
強度しきい値が設定され、充電状態が 2 ~ 6 の範囲で設定されています。動的除外は 40 秒に設定され、質量許容値は 10 に維持されています。次のパラメータセットには MS-MS パラメータが含まれます。
分離モードは四重極で選択されており、分離窓は2に設定され、分離オフセットはオフに設定されており、活性化タイプは通常プロテオミクス実験のHCDです。衝突エネルギーは固定するか、またはアシストすることができます。標識されたサンプルは、より高い衝突エネルギーを必要とするため、iTRAQ実験では衝突エネルギーを35に設定し、LFQ実験では30に設定することが推奨されます。
ここで使用される検出器のタイプはオービットラップです。スキャン範囲モードは自動になります。他のパラメータは、iTRAQ実験およびラベルフリー定量実験のデフォルトです。
概要をクリックすると、実験に使用されるすべての LC パラメータと MS パラメータの概要が表示されます。あなたは一つ一つのパラメータを見て、校正を行うことができます。それが完了したら、ファイルをクリックしてメソッドファイルとして保存します。
保存すると、メソッドを実行すると、生のファイルが取得されます。そして、これらの生のファイルは、プロテオーム発見ソフトウェアを使用して分析することができます。この図は、BSAのシーケンスカバレッジを3つの技術的な反復で示しています。
これは、機器の再現性を示しています。さて、この図は、3つの異なる生物学的サンプルで同定されたペプチドスペクトル一致、ペプチド、およびタンパク質の数における均一性を示しており、これは再び、装置の再現性に関するアイデアを与える。ここで、ベン図は、ラベルフリー実験およびラベルベースの実験において、3つの異なるサンプルで同定された一般的なタンパク質および排他的タンパク質を表す。
これらの棒グラフは、LFQおよびiTRAQ実験で同定された1%FDR後のペプチドスペクトル一致、ペプチド基、総タンパク質、タンパク質基、およびタンパク質数の数を示す。生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。組織定量プロテオーム分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。
技術的な反復の使用はサンプルが異なった時間ポイントで実行される場合でさえ、良い再現性を保障する。ここでは、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスの2つの定量方法を用いて組織サンプルの分析を示しました。定量的プロテオミクス技術の選択は、サンプルの数、MSプラットフォームの利用可能性、および対処されるべき生物学的問題に依存し得る。
