Proteinlerin doğru nicel ölçümleri, hastalığı biyolojiye geri anlamak için proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini anlamak için çok önemlidir. Bu deneyin genel amacı, doku örnekleri için entegre bir nicel proteomik iş akışı sağlamak ve biyobelirteç keşfi için etiketsiz ve etiket tabanlı protein profillemeyi birleştirmektir. Bu çalışmada, etiket tabanlı ve etiketsiz yaklaşımlar kullanarak proteinleri ölçmek için Orbitrap Fusion enstrümanını kullandık.
Doku lizisi, bir LC-MS-MS deneyinin başarısı için en önemli adımlardan biridir. Boncuk dövme tüpüne 30 mg doku alın. PBS ile yıkadıktan sonra, sekiz azı dişi üre, Tris, NaCl ve MgCl2 içeren 300 mikroliter üre liziz tamponu ekleyin.
Sonda sonicator kullanarak, dokunun içeriğini çiy. Bunu başka bir döngü için tekrarlayın. Tüpün dibinde sağlam bir doku gözlemlerseniz, tüpe zirkonyum boncuklar ekleyin ve dokuyu buz üzerinde beş dakika inkübasyon ile 90 saniye boyunca boncuk çırpıcı kullanarak homojenize edin.
Hücre kalıntılarını üstndan ayırmak için örnekleri 6000 G civarında 15 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatant'ı taze bir tüpte toplayın ve çözeltiyi düzgün bir şekilde karıştırın. Bradford reaktifini kullanarak dokudaki protein konsantrasyonu ölçülsün.
Bunun için, numunenin OD'sini 595 nanometre olarak ölçün ve bu ekranda gösterildiği gibi standart bir grafik kullanarak tahmin edin. Protein nicelimini takiben, lysates kalitesini kontrol etmek için% 12 SDS-PAGE jel üzerinde 10 mikrogram doku lysate çalıştırın. Çözelti içi sindirimin ilk adımı, TCEP kullanılarak disülfid bağların azaltılmasını içerir.
TCEP'in eklenmesinden sonra, tüpün içeriğini 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Bir sonraki adım, azaltılmış disülfid bağların yeniden oluşmasını önlemek için alkilasyon içerir. İodoasetamid gibi bir alkilasyon maddesi ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın.
Kuluçkadan sonra, dört ila sekiz hacimli seyreltme tamponu ile seyrelterek son üre konsantrasyonunu bir azı dişinden daha az bire düşürür. Bu noktada, pH'ı kontrol etmeniz önerilir. Bir sonraki adım, tüpe tripsin eklenmesini ve verimli sindirim için tüpün bir gecede kuluçkaya yatırılmasını içerir.
Ertesi gün, sindirilen peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun ve tuzdan arındırma adımına devam edin. Peptitlerin tuzdan arındırmasını gerçekleştirmek için C18 sahne uçlarını kullanın. 50 mikroliter metanol ekleyerek C18 sahne ucunu etkinleştirin, ucu iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüjleyin.
Şimdi, sahne ucunu yıkamak için % 0.1 formik aside 50 mikroliter asetonitril ekleyin ve yine ucu santrifüjleyin. Kurutulmuş sindirilmiş peptitleri% 0.1 formik asit 50 mikroliterde yeniden inşa edin. Yeniden inşa edilen peptitleri etkinleştirilmiş sahne ucuna ekleyin.
Bu adımı en az dört kez yineleyin. Numuneyi yıkamak için% 0.1 formik asit 50 mikroliter ekleyin ve santrifüjasyon adımını tekrarlayın. Peptitlerin salınımı için, % 0.1 formik aside% 40 ACN'lik 50 mikroliter ekleyin ve santrifüjleme ile sahne ucundan geçirin.
Bu adımı % 50 ve% 60 ACN ile% 0.1 formik asitte tekrarlayın ve filtratları taze bir tüpte toplayın. Tuzdan arındırımış peptitleri vakumlu bir konsantratör kullanarak kurutun. LC-MS-MS çalıştırmadan önce Scopes yöntemini kullanarak peptitleri ölçün.
Bunun için, bir mikro damla plakasının kuyusuna iki mikrolitre yeniden inşa edilmiş numune yükleyin ve emiciliği 205 nanometre ve 280 nanometre olarak ölçün. Konsantrasyonu bu slaytta açıklanan formülden hesaplayın. Tuzdan arındırılanmış peptitler kurutulduktan sonra etiket bazlı niceleme için hazırdır.
iTRAQ etiketleme için, kurutulmuş peptitler iTRAQ etiketleme kitinde sağlanan 20 mikroliter çözünme tamponunda yeniden inşa edilmelidir. Kitte bulunan şişeden etanol ekleyerek etiketleri yeniden inşa edin ve iyice karıştırın. Tüm adımların üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilmesi tavsiye edilir.
Homojen bir şekilde karıştırılan iTRAQ etiketlerini ilgili tüplerine ekleyin ve etiketleme reaksiyonun gerçekleşmesine izin verin. Reaksiyonun sonunda, MS sınıfı su ekleyerek tüpteki fazla sınırsız etiketi söndürin ve yarım saat ila bir saat kuluçkaya yatırın. Şimdi, etiketli tüm içeriği tek bir tüpe aktarın ve etiketli peptitleri kurutun.
Örnekleri% 0.1 formik asitte yeniden inşa ettikten sonra, NanoLC'nin otosamplerini açın ve örnekleri otomatik örnekleyicinin içine yerleştirin. Numuneler otosampe yerleştirildikten sonra sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi için doğru parametrelerin belirlenmesi önemlidir. Burada, LC-MS kullanarak hem etiketsiz nicelik hem de iTRAQ tabanlı nicelik için parametreleri açıklıyoruz.
Etiketsiz nicelik durumunda, tek bir kırılmamış numune enjekte edilirken 120 dakikalık bir degrade kullanılmıştır. Bu süre, örnek karmaşıklığına bağlı olarak artırılabilir veya azaltılabilir. Bu deneyde, %1 formik asitte %80 asetonitril olan B çözeltisi için aşağıdaki gradyan ile dakikada 300 nanoliterlik bir akış ayarlanmıştır.
Aynı şekilde, bir iTRAQ deneyi için bir degrade ayarlayabiliriz. Numuneler kırılmadığı için 90 dakikalık bir degrade kullanılmıştır. Hem etiketsiz niceleme hem de iTRAQ etiket tabanlı niceleme için MS parametreleri burada görülebilir.
İlk adım, genel parametrelere tıklayarak uygulama modunu ayarlamayı içerir. Peptit modunu seçin ve yöntem süresini kullanılan LC degradeye göre ayarlayın. Deneme için tarama parametrelerini tanımlayın.
MS-OT seçeneği tıklatınce parametreler görünür hale gelir. Kullanılan dedektör türü Orbitrap olarak ayarlanır. Bu cihazdaki diğer seçenek bir iyon tuzağı içerir.
Çözünürlük 60.000 olarak ayarlanmıştır ve denemenin ihtiyacına ve türüne bağlı olarak mevcut farklı seçenekler arasında seçim yapabilirsiniz. Kütle aralığı normaldir ve tarama aralığı 375 ile 1700 arasında ayarlanır. Diğer parametreler MS Uygulaması için varsayılandır.
Yoğunluk eşiği ve şarj durumu iki ile altı arasında ayarlandı. Dinamik dışlama 40 saniye olarak ayarlandı ve kütle toleransı 10 olarak tutuldu. Sonraki parametre kümesi MS-MS parametrelerini içerir.
İzolasyon modu dörtgen, yalıtım penceresi ikiye ayarlanmış, yalıtım uzaklığı kapalı olarak ayarlanmış ve etkinleştirme türü genellikle proteomik deney için HCD'dir. Çarpışma enerjisi sabitlenebilir veya yardımcı olabilir. Etiketli numuneler daha yüksek çarpışma enerjileri gerektirir, bu nedenle iTRAQ deneyleri için çarpışma enerjisinin 35'e ayarlanabilmesi tavsiye edilirken, LFQ deneyleri için 30 olarak ayarlanabilir.
Burada kullanılan dedektör tipi Orbitrap'tır. Tarama aralığı modu otomatik olacaktır. Diğer parametreler iTRAQ denemeleri ve etiketsiz nicel denemeler için varsayılandır.
Özete tıklanın, deneme için kullanılan tüm LC ve MS parametrelerine genel bir bakış sağlayacaktır. Her parametreye bir göz atabilir ve düzeltmeyi yapabilirsiniz. Bu yapıldıktan sonra, dosyaya tıklayın ve bir yöntem dosyası olarak kaydedin.
Kaydettikten sonra, yöntemi çalıştırabilirsiniz ve ham dosyaları alırsınız. Ve sonra bu ham dosyalar Proteome Discoverer yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Bu rakam, BSA'nın sıra kapsamını üç teknik yinelemede gösterir, bu da üç yinelemede% 91'dir.
Bu, cihazın tekrarlanabilirliğini gösterir. Şimdi, bu rakam, üç farklı biyolojik örnekte tanımlanan peptit spektral eşleşmeleri, peptitler ve proteinlerin sayısındaki tekdüzeliği göstermektedir, bu da yine cihazın tekrarlanabilirliği hakkında bir fikir vermektedir. Burada, Venn diyagramı etiketsiz deney ve etiket tabanlı deneyde üç farklı örnekte tanımlanan yaygın ve özel proteinleri temsil eder.
Bu çubuk grafikler, LFQ ve iTRAQ deneylerinde tanımlanan%1 FDR'den sonra peptit spektral eşleşmelerinin, peptit gruplarının, toplam proteinlerin, protein gruplarının ve protein sayısını gösterir. Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar.
Teknik çoğaltmaların kullanımı, numuneler farklı zaman noktalarında çalıştırılsa bile iyi tekrarlanabilirlik sağlar. Burada, doku örneklerinin iki nicellik yöntemi kullanılarak analizini gösterdik: etiketsiz ve etiket bazlı proteomik. Nicel proteomik tekniklerin seçimi, numune sayısına, MS platformlarının kullanılabilirliğine ve ele alınacak biyolojik soruya bağlı olabilir.
