يصف هذا البروتوكول طريقة طلاء لتقييد نمو الخلايا البطانية إلى منطقة محددة من لوحة من 6 آبار لتطبيق الإجهاد المطلق باستخدام نموذج شاكر المداري. وهناك طريقة شائعة لدراسة آثار التدفق على البطانة هو زراعة الخلايا البطانية في لوحات متعددة الآبار الثقافة على شاكر المدارية. شاكر المدارية يحفز موجة تدور حول البئر.
الخلايا في مركز تجربة جيدا هذا النوع من التدفقات التي يعتقد أنها تؤدي إلى تصلب الشرايين. الخلايا أقرب إلى تدفق تجربة الحافة التي يعتقد أن تكون واقية. يفترض أن خصائص الخلايا في كل منطقة تعتمد على الضغوط الهائلة التي تواجهها.
ومع ذلك، هناك أرضية محتملة في هذا المنطق. تطلق الخلايا البطانية الوسطاء بطريقة تعتمد على التدفق. وسيصل هؤلاء الوسطاء إلى تركيز موحد في الوسط الدوار، وبالتالي سيؤثرون على الخلايا في مناطق أخرى غير تلك التي أطلق سراحهم فيها.
قد يؤدي ذلك إلى تلف أو إخفاء التأثيرات الحقيقية للقص على سلوك الخلية. لا يقتصر التأثير على نظام البئر الدوار. قد يحدث حتى في نماذج بسيطة، مثل غرفة تدفق لوحة موازية.
ويمكن تجنبه عن طريق زراعة الخلايا في جزء واحد فقط من النظام. هنا، ونحن نصف أساليب للسماح الالتصاق الخلية فقط في المركز أو فقط على حافة البئر دوامة. تصنيع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ.
تصنيع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ من الصف 316 الفولاذ المقاوم للصدأ وفقا لرسم الهندسية المقدمة. الطباعة ثلاثية الأبعاد على PDMs. إعداد نموذج CAD ثلاثي الأبعاد من قالب PDMs باستخدام SOLIDWORKS وفقا للرسم الهندسي المقدم.
تصدير طراز CAD إلى ملف STL واستيراد ملف STL إلى Cura 2.6.2. شريحة النموذج إلى طبقات مع سرعة الطباعة من 50 ملليمتر في الثانية وكثافة التعبئة من 60٪ تصدير الملف كGCode. تحميلها إلى طابعة أولتيميكر 3D للطباعة.
استخدم حمض البوليلاكتيك كمادة الطباعة. صب خاتم PDMS. مزيج قاعدة PDMS وعامل المعالجة بشكل جيد مع نسبة 90.9٪ قاعدة و 9.1٪ عامل المعالجة.
صب الحل مختلطة جيدا في القالب المطبوعة 3D. إزالة فقاعات في فراغ غرفة إزالة الغاز. عالجه لمدة ساعة في فرن 80 درجة.
اسمح لحلقة PDMS بالتبريد لدرجة حرارة الغرفة. ثم إزالة حلقة PDMS الشفاء بعناية من القالب. إعداد 1٪ Pluronic F-127.
تزن خمسة غرامات من Pluronic F-127. صب في زجاجة. ثم أضف مائة ميل من مياه ميلي كيو إلى الزجاجة.
وهذا يعطي 5٪ Pluronic F-127 الحل. تأكد من أن جميع مسحوق Pluronic F-127 مغمور في الماء. أغلق الغطاء و الأوتوكلاف باستخدام برنامج دورة التعقيم السائل.
دع الحل يبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. إضافة 10 مل من 5٪ Pluronic F-127 حل إلى 40 مل من المياه ميلي كيو autoclaved لجعل 1٪ Pluronic F-127 الحل. أداء التخفيف في غطاء خزانة السلامة البيولوجية.
تخزين كل من 1٪ و 5٪ Pluronic F-127 في درجة حرارة الغرفة. طلاء من لوحة 6-جيدا. وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ الأوتوكلاف، حلقة PDMS، وملاقط قبل الاستخدام.
إجراء جميع الإجراءات اللاحقة في غطاء محرك السيارة BSC ومراقبة التقنيات العقيمة لضمان العقم. ضع حلقة PDMS في 6-well باستخدام ملاقط. استخدم الحافة الخارجية لحلقة PDMS لمحاذاة حلقة PDMS بشكل متحد المركز داخل البئر.
ملاحظة، ينبغي استخدام لوحات فقط غير الأنسجة ذات الاستزراع الجيد. ضع وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ على رأس حلقة PDMS باستخدام ملاقط. إدراج نصائح من كماشة حلقة الاحتفاظ الداخلية في قبضة يحمل من حلقة الاحتفاظ.
اضغط على حامل لتقليل قطر حلقة الاحتفاظ. وضعه في 6-جيدا، اضغط عليه بقوة على وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ، والإفراج عن كماشة لتأمين حلقة PDMS في البئر. إضافة ميل واحد من خمسة ميكروغرام لكل فيبروكتين ميكرولتر في وسط أو حافة البئر، اعتمادا على المنطقة ذات الاهتمام، من خلال فتح حلقة PDMS والفولاذ المقاوم للصدأ وحدة.
دوامة لوحة لضمان حل فيبروكتين يغطي جميع المنطقة ذات الاهتمام. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة في حاضنة رطبة تحت 95٪ الهواء و 5٪ CO2. إزالة محلول فيبروكتين من البئر.
والآن يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني. مرة واحدة القيام به، وإزالة برنامج تلفزيوني تماما من البئر. إزالة خاتم الاحتفاظ، وحدة الفولاذ المقاوم للصدأ، وحلقة PDMS من البئر.
إضافة 1.5 ميل من 1٪ Pluronic F-127 في البئر واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتمرير السطح غير المصقول. إزالة محلول Pluronic F-127 من البئر وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. مرة واحدة غسلها، واستخدام المغلفة جيدا على الفور أو تخزين في أربع درجات لمدة تصل إلى أسبوعين مع طبقة من برنامج تلفزيوني في البئر المغلفة.
بذر الخلايا البطانية. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والبذور 180،000 الخلايا في لوحة مغلفة 6-جيدا في 1.5 ميل من المتوسط ثقافة الخلية قبل الحارة. يهز لوحة البئر أفقيا لضمان توزيع الخلايا بالتساوي في البئر.
اتركها في حاضنة رطبة 37 درجة تحت 95٪ هواء و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. تطبيق الإجهاد القص باستخدام شاكر المدارية. يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء بعد ثلاثة أيام من النمو.
استبدال المتوسطة مع 1.9 ميل من قبل تحذير خلية الثقافة المتوسطة لتحقيق ارتفاع 2 ملليمتر. ضع لوحة بئر على منصة شاكر مداري في حاضنة رطبة ودوامة في 150 دورة في الدقيقة لمدة ثلاثة أيام. اختياري, بعد يومين من القص, يمكن إضافة السيتوكينات إلى الخلايا ثقافة المتوسطة للتحقيق في التفاعل بين السيتوكينات والإجهاد محض.
بعد العلاج، قص الخلايا ليوم آخر. في هذه الدراسة، تم استخدام TNF-ألفا لتنشيط الخلايا. إجراء تحليل بعد ثلاثة أيام من تطبيق الإجهاد القص.
تظهر صور المجهر أن Pluronic F-127 منع التصاق HUVEC بالمنطقة دون طلاء فيبروكتين. لم يتم إرفاق HUVECs إلى جزء من سطح البئر التي لم يتم المعالجة مسبقا مع فيبروكتين قبل تخميل Pluronic F-127 بعد 24 ساعة، في الشكل A، و 72 ساعة، في الشكل C، من النمو. بدون صعق Pluronic F-127 ، تم ربط HUVECs بالسطح دون فيبروكتين ، بعد 24 ساعة من البذر ، في الشكل B ، وانتشرت أكثر بمقدار 72 ساعة ، في الشكل D.The مقياس شريط يساوي 500 ميكرومتر.
تظهر البقعة الحمراء النووية مورفولوجيا HUVECs المقصة ، A ، في الوسط ، و B ، على حافة بئر كامل. شريط المقياس يساوي 100 ميكرومتر. A و B تظهر أيضا الخطوط العريضة للخلية التي حددها مناعة ZO-1.
لاحظ محاذاة الخلايا وإطالتها عند الحافة ولكن ليس في المركز. وهو لا يظهر فرقا كبيرا في مؤشر الشكل النووي، مما يشير إلى التقريب، بين مركبات الكربون الهيدروفلورية التي تزرع في آبار كاملة البئر والمجزئة التي شوهدت لمركبات HUVECs غير المعالجة أو المعالجة من TNF-alpha. كانت الخلايا ممدودة أكثر بالقرب من حافة البئر.
ولم يكن الاتجاه نحو استطالة أكبر في مركبات HUVECs المعالجة من TNF-alpha مهما باستمرار عبر المواقع. ولم يلاحظ فرق كبير بين الآبار الكاملة والمجزئة في عدد الكثافة من مركبات HUVECs المعالجة بألفا في مواقع شعاعية مختلفة. في كلتا الحالتين، كان هناك عدد أكبر من الخلايا لكل وحدة منطقة على الحافة مما كانت عليه في وسط البئر.
في الختام، الطريقة التي حددناها هنا تسمح لك بزراعة الخلايا في منطقة واحدة فقط من البئر الدوار أو في الواقع، أي نظام ثقافة الخلايا القائمة على البلاستيك. وهذا يعني أن الخلايا في جزء واحد من البئر التي تعاني من نوع واحد من التدفق لا تتأثر بالوسطاء الذين يتم إطلاق سراحهم من الخلايا في منطقة أخرى تعاني من تدفقات مختلفة. ليس ذلك فحسب، يمكننا أن ننظر إلى الخلايا التي تزرع في منطقة واحدة مع أو بدون خلايا تزرع في مناطق أخرى.
وهذا يسمح بإظهار آثار هؤلاء الوسطاء القابلين للذوبان. اختبار آثار المتوسطة مشروطة على الخلايا السذاجة يسمح الشيء نفسه. من خلال تحليل متوسط الحالة ، يمكن تحديد الوسطاء.
