Bu protokol, endotel hücre büyümesini yörüngesel çalkalayıcı modelini kullanarak saf stres uygulaması için 6 kuyulu bir plakanın belirli bir bölgesiyle sınırlamak için bir kaplama yöntemini açıklar. Akışın endotel üzerindeki etkilerini incelemenin yaygın bir yolu, çok kuyulu kültür plakalarındaki endotel hücrelerini bir yörünge çalkalayıcı üzerinde kültüre etmektir. Yörüngesel çalkalayıcı kuyunun etrafında dönen bir dalgaya neden oldu.
Kuyunun merkezindeki hücreler, ateroskleroza yol açacağı düşünülen akışları yaşarlar. Kenara daha yakın hücreler, koruyucu olduğu düşünülen akışı yaşar. Her bölgedeki hücrelerin özelliklerinin yaşadıkları saf streslere bağlı olduğu varsayılır.
Ancak, bu mantıkta potansiyel bir zemin vardır. Endotel hücreleri, arabulucuları akışa bağlı bir şekilde serbest bırakır. Bu aracılar dönen ortamda tek tip bir konsantrasyona ulaşacak ve bu nedenle salındıkları bölge dışındaki bölgelerdeki hücreleri etkileyecektir.
Bu, kesmenin hücre davranışı üzerindeki gerçek etkilerini bozabilir veya gizleyebilir. Etki dönen kuyu sistemi ile sınırlı değildir. Paralel plaka akış odası gibi basit modellerde bile ortaya çıkabilir.
Sistemin sadece bir bölümünde hücre yetiştirilerek önlenebilir. Burada, hücre yapışıklığına izin veren yöntemleri sadece merkezde veya sadece dönen kuyunun kenarında açıklıyoruz. Paslanmaz çelik modülün imalatı.
Paslanmaz çelik modülü, sağlanan bir mühendislik çizimine göre 316 paslanmaz çelikten üretin. PDM'lerde 3D baskı. Sağlanan mühendislik çizimine göre SOLIDWORKS kullanarak PDM'lerin kalıplarının 3D CAD modelini hazırlayın.
CAD modelini bir STL dosyasına verin ve STL dosyasını Cura 2.6.2'ye alın. Modeli saniyede 50 milimetre baskı hızı ve %60 dolum yoğunluğu ile katmanlar halinde dilimleyin Dosyayı GCode olarak dışa aktarın. Yazdırma için ultimaker 3D yazıcıya yükledim.
Baskı malzemesi olarak polilaktik asit kullanın. PDMS halkasının dökümü. PDMS tabanını ve kürleme maddesini %90,9 baz ve %9,1 kürleme maddesi oranıyla iyice karıştırın.
İyi karıştırılır çözeltiyi 3D baskılı kalıba dökün. Vakum gaz giderme odasında kabarcıkları çıkarın. 80 derecelik bir fırında bir saat boyunca tedavi edin.
PDMS halkasının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Daha sonra kürlenmiş PDMS halkasını kalıptan dikkatlice çıkarın. %1 Pluronic F-127 hazırlanması.
Beş gram Pluronic F-127 tartın. Cam şişeye dökün. Daha sonra cam şişeye yüz milyon Milli-Q su ekleyin.
Bu% 5 Pluronic F-127 çözümü verir. Tüm Pluronic F-127 tozlarının suya batırıldığından emin olun. Kapağı kapatın ve sıvı sterilizasyon döngüsü programı kullanarak otoklavlayın.
Kullanmadan önce çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın. %1 Pluronic F-127 çözümü yapmak için 40 milyon otomatik kapatılmış Milli-Q suya 10 milyon %5 Pluronic F-127 çözeltisi ekleyin. Seyreltme işlemi biyogüvenlik kabini davlumbazında gerçekleştirin.
Oda sıcaklığında hem %1 hem de %5 Pluronic F-127 depolayın. 6 kuyu plakası kaplaması. Kullanmadan önce paslanmaz çelik modülü, PDMS halkasını ve cımbızı otoklavlav.
Sonraki tüm prosedürleri bir BSC davlumbazında gerçekleştirin ve steriliteyi sağlamak için aseptik teknikleri gözlemleyin. PDMS halkasını cımbız kullanarak 6 kuyuya yerleştirin. PDMS halkasını kuyu içinde merkezi olarak hizalamak için PDMS halkasının dış kenarını kullanın.
Sadece doku kültürü ile tedavi edilmemiş kuyu plakaları kullanılmalıdır. Paslanmaz çelik modülü cımbız kullanarak PDMS halkasının üzerine yerleştirin. İç tutucu halka pensesinin uçlarını tutucu halkanın tutma muhafazalarına yerleştirin.
tutucunun çapını azaltmak için tutucuyu sıkın. 6 kuyuya koyun, paslanmaz çelik modüle sıkıca bastırın ve PDMS halkasını kuyuda sabitlemek için penseyi serbest bırakın. PDMS halkası ve paslanmaz çelik modülün açılmasıyla, ilgi alanına bağlı olarak kuyunun ortasına veya kenarına mikroliter fibronektin başına beş mikrogramdan bir milyon mil ekleyin.
Fibronektin çözeltisinin tüm ilgi çekici bölgeyi kapsadığından emin olmak için plakayı döndürün. %95 hava ve %5 CO2 altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatır. Fibronektin çözeltisini kuyudan çıkarın.
Ve şimdi PBS ile iki kez yıkayın. Tamamlandığında, PBS'yi kuyudan tamamen çıkarın. Saklama halkasını, paslanmaz çelik modülü ve PDMS halkasını kuyudan çıkarın.
Kuyuya 1,5 milyon% 1 Pluronic F-127 ekleyin ve kaplamasız yüzeyi geçmek için oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Pluronic F-127 çözeltisini kuyudan çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Yıkandıktan sonra, kaplanmışı hemen iyi kullanın veya kaplanmış kuyuda PBS tabakası ile iki haftaya kadar dört derecede saklayın.
Endotel hücrelerinin tohumlama. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 180.000 hücreyi 1,5 milyon ön-ılık hücre kültürü ortamında kaplanmış 6 kuyulu bir plakaya koyun. Hücrelerin kuyuda eşit şekilde dağılmasını sağlamak için kuyu plakasını yanal olarak sallayın.
Bir gecede % 95 havanın altında ve% 5 CO2'nin altında 37 derece nemlendirilmiş bir inkübatörde bırakın. Yörüngesel çalkalayıcı kullanarak kesme gerilme uygulaması. Hücreler üç günlük büyümeden sonra birleştiğine ulaşmalıdır.
İki milimetre yüksekliğe ulaşmak için ortamı 1,9 milyon önceden uyarı hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Nemlendirilmiş bir inkübatörde yörüngesel çalkalayıcının platformuna iyi bir plaka yerleştirin ve üç gün boyunca 150 RPM'de döndürün. İsteğe bağlı olarak, iki günlük kesmeden sonra, sitokinler ve saf stres arasındaki etkileşimi araştırmak için hücre kültürü ortamına sitokinler eklenebilir.
Tedaviden sonra, hücreleri başka bir gün için kesin. Bu çalışmada hücreleri aktive etmek için TNF-alfa kullanılmıştır. Üç günlük kesme stresi uygulamasından sonra analiz yapın.
Mikroskop görüntüleri, Pluronic F-127'nin fibronektin kaplaması olmadan bölgeye HUVEC yapışıklıklarını önlediğini göstermektedir. Kuyu yüzeyinin 24 saat sonra Pluronic F-127'nin geçişinden önce fibronektin ile ön işlem yapılmamış kısmına A ve 72 saat olarak C olarak büyüme olarak hiçbir HUVEC bağlanmamıştır. Pluronic F-127 pasivasyonu olmadan, HUVEC'ler fibronektin olmadan yüzeye, tohumlamadan 24 saat sonra, B şekliyle tutturuldu ve D.Skala çubuğu 500 mikrometreye eşittir.
Nükleer Kırmızı leke, tam bir kuyunun kenarında, merkezde A ve B'de yamluklu HUVEC'lerin morfolojisini gösterir. Ölçek çubuğu yüz mikrometreye eşittir. A ve B ayrıca ZO-1'in immünostainasyonu ile tanımlanmış hücre ana hatlarını gösterir.
Kenardaki hücrelerin hizalanmasına ve uzamasına dikkat edin, ancak ortada değil. Nükleer şekil indeksinde, yuvarlaklığı gösteren önemli bir fark göstermez, tam olarak iyi yetiştirilen HUVEC'ler arasında ve tedavi edilmemiş veya TNF alfa ile tedavi edilmiş HUVEC'ler için segmentli kuyular görülmüştür. Hücreler kuyunun kenarına yakın daha uzundu.
TNF alfa ile işlenmiş HUVEC'lerde daha fazla uzama eğilimi, konumlar arasında sürekli olarak anlamlı değildi. Farklı radyal konumlarda A, işlenmemiş ve B, TNF alfa ile işlenmiş HUVEC'lerin yoğunluk sayısında tam ve parçalı kuyular arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Her iki durumda da, kenarda birim alan başına kuyunun ortasına göre daha fazla hücre vardı.
Sonuç olarak, burada özetlediğimiz yöntem, dönen kuyunun sadece bir bölgesinde veya gerçekten de herhangi bir plastik tabanlı hücre kültürü sisteminde hücre yetiştirmenizi sağlar. Bu, kuyunun bir bölümündeki hücrelerin bir akış türünün farklı akışlar yaşayan başka bir bölgedeki hücrelerden salınan aracılardan etkilenmediği anlamına gelir. Sadece bu değil, bir bölgede yetişen hücrelere bakabiliriz, diğer bölgelerde hücre yetiştirilse de yetiştirilmeden de.
Bu, bu tür çözünür arabulucuların etkilerinin gösterilmesini sağlar. Şartlandırılmış ortamın naif hücreler üzerindeki etkilerini test etmek de aynı şeye izin verir. Durum ortamı analiz edilerek, aracılar tanımlanabilir.
