פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום מתח מוחלט באמצעות מודל שייקר מסלולית. דרך נפוצה ללמוד את ההשפעות של זרימה על אנדותל היא לתרבות תאי אנדותל בצלחות תרבות רב-בארות על שייקר מסלולי. שייקר מסלולית גורם גל שמסתובב סביב הבאר.
תאים במרכז הבאר חווים את סוג הזרימות שנחשבות כמובילות לטרשת עורקים. תאים הקרובים יותר לזרימה של חוויית הקצה שנחשבת למגוננת. המאפיינים של התאים בכל אזור הם הניחו להיות תלויים הלחצים העצומים שהם חווים.
עם זאת, יש רצפה פוטנציאלית בלוגיקה זו. תאי אנדותל משחררים מתווכים באופן תלוי זרימה. מתווכים אלה יגיעו לריכוז אחיד במדיום המסתחרר ולכן ישפיעו על תאים באזורים שאינם אלה שבהם הם שוחררו.
זה עלול להשחית או להסתיר השפעות אמיתיות של ההטעיה על התנהגות התא. ההשפעה אינה מוגבלת למערכת הבאר המסתחררת. זה עלול להתרחש אפילו בדגמים פשוטים, כמו תא זרימת הלוח המקביל.
זה יכול להימנע על ידי גידול תאים רק בחלק אחד של המערכת. כאן, אנו מתארים שיטות להתיר הידבקות בתאים רק במרכז או רק בקצה הבאר המסתחררת. ייצור מודול נירוסטה.
פברק את מודול נירוסטה מפלדת אל-חלד בדרגה 316 בהתאם לרישום הנדסי שסופק. הדפסה תלת-ממדית על PDMs. הכן מודל CAD תלת-ממדי של עובש PDMs באמצעות SOLIDWORKS בהתאם לציור ההנדסי שסופק.
יצא את מודל CAD לקובץ STL וייבא את קובץ ה- STL לתוך Cura 2.6.2. פורסים את הדגם לשכבות במהירות הדפסה של 50 מילימטרים לשנייה וממלאים צפיפות של 60%ייצוא הקובץ כ- GCode. העלה אותו למדפסת תלת-ממד של Ultimaker להדפסה.
השתמש בחומצה פולילקטית כחומר ההדפסה. ליהוק טבעת PDMS. ערבבו היטב את בסיס ה-PDMS ואת סוכן הריפוי עם יחס של 90.9% בסיס ו-9.1% ריפוי סוכן.
יוצקים את הפתרון המעורב היטב לתוך התבנית המודפסת בתלת-ממד. הסר בועות בתא גמילה ואקום. תרפא את זה לשעה בכבשן של 80 מעלות.
אפשרו לטבעת PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסירו בזהירות את טבעת ה-PDMS שנרפאה מהתבנית. הכנה של 1%Pluronic F-127.
שוקלים חמישה גרם של F-127 פלרוני. יוצקים אותו לתוך בקבוק זכוכית. ואז להוסיף מאה מיליון מים מילי-Q לבקבוק הזכוכית.
זה נותן פתרון F-127 5%פלורוני. ודאו שכל אבקת ה-F-127 הפלורונית שקועה במים. סגור את המכסה וסגור אותו אוטומטית באמצעות תוכנית מחזור עיקור נוזלי.
תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוסף 10 מיליון של 5% פלורוני F-127 פתרון 40 מיל של מים מילי Q autoclaved לעשות 1% Pluronic F-127 פתרון. בצע את הדילול במכסה המנוע של ארון הביו-רוויה.
אחסן הן 1%והן 5%Pluronic F-127 בטמפרטורת החדר. ציפוי של צלחת 6 באר. מובלעת אוטומטית של מודול נירוסטה, טבעת PDMS ופינצ'רים לפני השימוש.
בצע את כל ההליכים הבאים במכסה המנוע BSC ולבחון טכניקות אספטיות כדי להבטיח סטריליות. הנח את טבעת ה- PDMS במרחק של 6 בארות באמצעות פינצטה. השתמש בקצה החיצוני של טבעת PDMS כדי ליישר את טבעת PDMS באופן קונצנטרי בתוך הבאר.
שימו לב, יש להשתמש רק בצלחות באר שאינן מטופלות בתרבית רקמות. הנח את מודול נירוסטה על גבי טבעת PDMS באמצעות פינצטה. הכנס את קצות צבת טבעת ההחזקה הפנימית לאחיזת האחיזה של הטבעת השומרת.
לסחוט את המחזיק כדי להפחית את הקוטר של הטבעת שמירה. שים אותו לתוך 6-טוב, לחץ אותו בחוזקה על מודול נירוסטה, ולשחרר את הצבת כדי לאבטח את טבעת PDMS בבאר. הוסף מיליון אחד של חמישה מיקרוגרם לכל מיקרוליטר פיברונקטין למרכז או לקצה הבאר, בהתאם לאזור העניין, דרך פתיחת טבעת PDMS ומודול נירוסטה.
מערבולת הצלחת כדי להבטיח את פתרון fibronectin מכסה את כל האזור של עניין. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות באינקובטור לח תחת 95% אוויר ו 5%CO2. הסר את פתרון פיברונקטין מהבאר.
ועכשיו לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר סיום, להסיר לחלוטין את PBS מן הבאר. הסר את טבעת ההחזקה, מודול נירוסטה וטבעת PDMS מהבאר.
הוסף 1.5 מיליון של 1% Pluronic F-127 לתוך הבאר ואת הדגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להעביר את פני השטח לא צבוע. הסר את פתרון ה-F-127 הפלורוני מהבאר ושטף שלוש פעמים עם PBS. לאחר שטף, להשתמש היטב מצופה מיד או לאחסן בארבע מעלות עד שבועיים עם שכבת PBS היטב מצופה.
זריעה של תאי אנדותל. לספור תאים באמצעות hemocytometer וזרע 180, 000 תאים לתוך צלחת מצופה 6 באר ב 1.5 מיליון של מדיום תרבות התא חם מראש. לנער את צלחת היטב לרוחב כדי להבטיח כי התאים להפיץ באופן שווה בבאר.
השאירו אותו באינקובטור לח ב-37 מעלות מתחת ל-95% אוויר ו-5%CO2 למשך הלילה. יישום מתח גזירה באמצעות שייקר מסלולית. תאים צריכים להגיע להתכנסות לאחר שלושה ימים של צמיחה.
החלף את המדיום עם 1.9 מיליון של מדיום תרבות התא מראש להזהיר כדי להשיג גובה של שני מילימטרים. מניחים צלחת באר על הרציף של שייקר מסלולי באינקובטור לח ומסחררים אותו במהירות של 150 סל"ד במשך שלושה ימים. אופציונלי, לאחר יומיים של גזירה, ציטוקינים ניתן להוסיף למדיום תרבות התא כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ציטוקינים ומתח מוחלט.
לאחר הטיפול, לגזירה התאים ליום אחר. במחקר זה, TNF-אלפא שימש להפעלת התאים. בצע ניתוח לאחר שלושה ימים של יישום מתח גזירה.
תמונות מיקרוסקופ מראות כי F-127 פלורוני מנע הידבקות HUVEC לאזור ללא ציפוי פיברונקטין. לא חוברו HUVECs לחלק של פני השטח היטב שלא טופלו מראש עם פיברונקטין לפני פסיבציה של F-127 פלורוני לאחר 24 שעות, באיור A, ו 72 שעות, באיור C, של צמיחה. ללא פסיבציה Pluronic F-127, HUVECs היו מחוברים אל פני השטח ללא fibronectin, 24 שעות לאחר הזריעה, באיור B, והם התפשטו עוד יותר על ידי 72 שעות, באיור D.The סרגל קנה המידה שווה 500 מיקרומטר.
כתם אדום גרעיני מראה את המורפולוגיה של HUVECs גזירה, A, במרכז, ו B, בקצה של באר מלאה. סרגל קנה המידה שווה למאה מיקרומטרים. A ו- B גם להראות קווי מתאר התא המסוים על ידי immunostaining של ZO-1.
שים לב ליישור ולהתארכות של תאים בקצה אך לא במרכז. זה לא מראה הבדל משמעותי במדד הצורה הגרעינית, המציין מעוגלה, בין HUVECs גדל בבארות מלאות ומפולחים נראו עבור HUVECs שאינם מטופלים או TNF-אלפא מטופלים. התאים היו מוארכים יותר ליד קצה הבאר.
נטייה להארכה גדולה יותר ב- HUVECs שטופלו ב- TNF-alpha לא הייתה משמעותית באופן עקבי בין מיקומים. לא נצפה הבדל משמעותי בין בארות מלאות ומפולגות במספר הצפיפות של HUVECs A, לא מטופלים ו- B, TNF-אלפא-מטופלים במקומות רדיאליים שונים. בשני המקרים, היו יותר תאים ליחידת שטח בקצה מאשר במרכז הבאר.
לסיכום, השיטה שתיארנו כאן מאפשרת לך לגדל תאים באזור אחד בלבד של המערבולת היטב או אכן, של כל מערכת תרבית תאים מבוססת פלסטיק. משמעות הדבר היא שתאים בחלק אחד של הבאר חווים סוג אחד של זרימה אינם מושפעים ממתווכים המשתחררים מתאים באזור אחר החווים זרימות שונות. לא רק זה, אנחנו יכולים להסתכל על תאים הגדלים באזור אחד עם או בלי תאים גדלים באזורים אחרים.
זה מאפשר להפגין את ההשפעות של מתווכים מסיסים כאלה. בדיקת ההשפעות של מדיום מותנה על תאים נאיביים מאפשר את אותו הדבר. על-ידי ניתוח מדיום התנאי, ניתן לזהות את המתווכים.
