このプロトコルは、軌道シェーカーモデルを使用した全応力適用のために、内皮細胞の成長を6ウェルプレートの特定の領域に制限するコーティング方法を説明する。内皮に対する流れの影響を研究する一般的な方法は、軌道シェーカー上のマルチウェル培養プレートの内皮細胞を培養することです。軌道シェーカーは、井戸の周りを回転する波を誘発する。
ウェルの中心にある細胞は、アテローム性動脈硬化症につながると考えられている流れの種類を経験します。保護と考えられているエッジエクスペリエンスフローに近いセル。各領域の細胞の特性は、それらが経験する完全な応力に依存すると仮定されます。
しかし、このロジックには潜在的な床があります。内皮細胞は、フロー依存的な方法でメディエーターを放出する。これらのメディエーターは、渦巻き培地中で均一な濃度に達するため、それらが放出された領域以外の領域の細胞に影響を与えます。
それは細胞の動作にせん断の真の影響を壊したり隠したりする可能性があります。効果は、旋回ウェルシステムに限定されません。平行な版の流れの部屋のような簡単なモデルでさえ起こり得る。
これは、システムの一部で細胞を成長させることによって回避することができます。ここでは、細胞接着を中央のみ、または旋回ウェルの端にのみ許可する方法について説明する。ステンレス鋼モジュールの製作。
提供された工学図面に従って等級316ステンレス鋼からステンレス鋼モジュールを製造する。PDM での 3D プリント: 提供されているエンジニアリング図面に従って SOLIDWORKS を使用して PDM 金型の 3D CAD モデルを準備します。
CAD モデルを STL ファイルにエクスポートし、STL ファイルを Cura 2.6.2 にインポートします。モデルを 1 秒あたり 50 ミリメートルの印刷速度でレイヤーにスライスし、面材密度を 60% GCode としてファイルをエクスポートします。印刷用のUltimaker 3Dプリンタにアップロード。
印刷材料としてポリ乳酸を使用します。PDMSリングのキャスティング。PDMSベースと硬化剤を90.9%基剤と9.1%硬化剤の比率とよく混ぜます。
3D プリントされた金型に、よく混合した溶液を注ぎます。真空脱気室の気泡を除去します。80度の炉で1時間硬化させます。
PDMSリングを室温まで冷却します。次に、硬化したPDMSリングを金型から慎重に取り外します。1%プルロニックF-127の調製。
プルロニックF-127の5グラムを計量します。ガラス瓶に注ぎます。その後、ガラス瓶にミリQ水の百ミルを追加します。
これにより、5%Pluronic F-127溶液が与えられる。すべてのプルロニックF-127粉末が水中に沈み込むよう確認します。キャップを閉じ、液体滅菌サイクルプログラムを使用してオートクレーブします。
使用前に溶液を室温まで冷まします。1%プルロニックF-127溶液を40ミルのオートクレーブミリ-Q水に10ミル加え、1%プルロニックF-127溶液を作ります。バイオセーフティキャビネットフードで希釈を行います。
室温で1%と5%のプルロニックF-127の両方を保管してください。6ウェルプレートのコーティング。使用前にオートクレーブステンレス鋼モジュール、PDMSリング、ピンセット。
BSCフードで後続の手順をすべて実行し、無菌技術を観察して無菌性を確保します。ピンセットを使用して、PDMSリングを6ウェルに入れ。PDMS リングの外部リムを使用して、PDMS リングをウェル内で同心円状に整列します。
なお、非組織培養処理ウェルプレートのみを使用すべきである。ピンセットを使用して、PDMSリングの上にステンレス製モジュールを置きます。内部保持リングペンチの先端を保持リングのグリップ保持に挿入します。
ホルダーを絞って、保持リングの直径を小さくします。6ウェルに入れ、ステンレス製のモジュールにしっかりと押し込み、ペンチを放してPDMSリングを井戸に固定します。PDMSリングとステンレス鋼モジュールの開口部を通じて、関心領域に応じて、ウェルの中央または端にマイクロリットルフィブロネクチンあたり5マイクログラムの1ミルを追加します。
フィブロネクチン溶液が関心のあるすべての領域をカバーすることを確実にするためにプレートを旋回する。95%の空気と5%のCO2の下で加湿インキュベーターで37度で30分間インキュベート。フィブロネクチン溶液を井戸から取り除く。
そして今、PBSで2回洗います。完了したら、完全に井戸からPBSを削除します。保持リング、ステンレス製モジュール、PDMSリングをウェルから取り外します。
1%Pluronic F-127の1.5ミルを井戸に加え、室温で1時間インキュベートしてコーティングされていない表面をパッシベートします。ウェルからプルロニックF-127溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。一度洗浄したら、すぐにコーティングされたウェルを使用するか、PBSの層をよくコーティングして最大2週間4度で保存します。
内皮細胞の播種。血球計を使用して細胞を数え、180,000個の細胞を1.5マイルのプレウォーム細胞培養培地でコーティングされた6ウェルプレートに入れた。ウェルプレートを横に振って、細胞がウェル内で均等に分配されるようにします。
湿度37度の加湿インキュベーターを95%の空気と5%のCO2の下に一晩放置してください。軌道シェーカーを使用したせん断応力適用。細胞は3日間の成長の後に合流するはずです。
培地を1.9マイルのプレ警告細胞培養培地に置き換え、高さ2ミリメートルを達成します。加湿インキュベーターの軌道シェーカーのプラットフォームにウェルプレートを置き、150 RPMで3日間旋回します。オプションで、2日間の剪断後、サイトカインを細胞培養培地に添加して、サイトカインと全くのストレスの相互作用を調べることができる。
治療後、別の日のために細胞を剪断する。本研究では、TNF-αを使用して細胞を活性化した。3日間のせん断応力適用後に解析を行います。
顕微鏡画像は、プロロニックF-127がフィブロネクチンコーティングなしで領域へのHUVEC接着を防止したことを示しています。24時間後にプロロニックF-127のパッシベーション前にフィブロネクチンで前処理されていなかったウェル表面の部分にHUVECが付着していなかった、図A、および72時間で、成長の。Pluronic F-127パッシベーションがなければ、HUVECはフィブロネクチンを含まない表面に付着し、播種後24時間、図Bで、さらに72時間増殖し、図D.スケールバーは500マイクロメートルに等しい。
核赤の汚れは、完全な井戸の端に、中央にせん断されたHUVEC、A、およびBの形態を示す。スケールバーは100マイクロメートルに相当します。AおよびBはまた、ZO−1の免疫染色によって線引く細胞の輪郭を示す。
エッジでのセルの配置と伸びは、中央には表示されません。これは、完全によく成長したHUVECと未治療またはTNFアルファ処理HUVECのためにセグメント化された井戸との間に丸みを示す核形状指数に有意な差を示さない。細胞は井戸の端付近でより細長かった。
TNF-α処理HUVECにおけるより大きな伸びの傾向は、一貫して場所を越えて有意ではなかった。Aの密度数、未処理、B、TNFアルファ処理HUVECの異なる半径方向の位置で、完全なウェルとセグメント化された井戸の間に有意な差は認められなかった。どちらの場合も、ウェルの中心よりもエッジの単位面積あたりのセル数が多かった。
結論として、ここで概説した方法は、任意のプラスチックベースの細胞培養システムの渦巻き井戸または実際に1つの領域で細胞を成長させることができます。つまり、あるタイプのフローを経験しているウェルの一部の細胞は、異なる流れを経験している別の領域の細胞から放出されたメディエーターの影響を受けません。それだけでなく、他の領域で細胞が増殖するかどうかにかかわらず、1つの領域で増殖した細胞を見ることができます。
これにより、このような可溶性メディエーターの効果が実証されます。ナイーブ細胞に対する条件付き培地の効果をテストすると、同じことが可能になります。条件媒体を分析することにより、メディエーターを特定することができる。
