Этот протокол описывает метод покрытия для ограничения роста эндотелиальных клеток определенной областью 6-луночной пластины для применения с использованием модели орбитального шейкера. Распространенным способом изучения влияния потока на эндотелий является культивирование эндотелиальных клеток в многоскентных культуральных пластинах на орбитальном шейкере. Орбитальный шейкер индуцирует волну, которая вращается вокруг колодца.
Клетки в центре скважины испытывают потоки, которые, как считается, приводят к атеросклерозу. Клетки ближе к краю испытывают поток, который считается защитным. Предполагается, что свойства клеток в каждой области зависят от чисто стрессов, которые они испытывают.
Тем не менее, в этой логике есть потенциальный пол. Эндотелиальные клетки высвобождают медиаторы в зависимости от потока. Эти медиаторы достигнут равномерной концентрации в закручивающейся среде и, следовательно, будут влиять на клетки в областях, отличных от той, где они были выпущены.
Это может испортить или скрыть истинные эффекты сдвига на поведение клеток. Эффект не ограничивается системой закрученных скважин. Это может произойти даже в простых моделях, таких как параллельная пластинчатая проточная камера.
Этого можно избежать, выращивая клетки только в одной части системы. Здесь мы описываем методы, позволяющие адгезию клеток только в центре или только на краю закручивающегося колодца. Изготовление модуля из нержавеющей стали.
Изготовить модуль из нержавеющей стали марки 316 в соответствии с предоставленным инженерным чертежом. 3D-печать на PPM. Подготовьте 3D CAD-модель пресс-формы PPM с помощью SOLIDWORKS в соответствии с предоставленным инженерным чертежом.
Экспортируйте модель САПР в STL-файл и импортируйте STL-файл в Cura 2.6.2. Нарежьте модель на слои со скоростью печати 50 миллиметров в секунду и плотностью заполнения 60% Экспортируйте файл в формате GCode. Загрузил его на 3D-принтер Ultimaker для печати.
Используйте полимолочную кислоту в качестве печатного материала. Литье кольца PDMS. Хорошо смешайте основание PDMS и отверждающий агент с соотношением 90,9% основания и 9,1% отверждающего агента.
Вылейте хорошо смешанный раствор в 3D-печатную форму. Удалите пузырьки в вакуумной дегазировке. Вылечите его в течение одного часа в печи с 80 градусами.
Дайте кольцу PDMS остыть до комнатной температуры. Затем аккуратно извлеките отвержденное кольцо PDMS из формы. Подготовка 1%Pluronic F-127.
Взвесьте пять граммов Pluronic F-127. Налейте его в стеклянную бутылку. Затем добавьте сто мил воды Milli-Q в стеклянную бутылку.
Это дает 5% раствор Pluronic F-127. Убедитесь, что весь порошок Pluronic F-127 погружен в воду. Закройте колпачок и автоклав с помощью программы цикла стерилизации жидкости.
Дайте раствору остыть до комнатной температуры перед использованием. Добавьте 10 мил 5%-ного раствора Pluronic F-127 к 40 мил автоклавной воды Milli-Q, чтобы получить 1%-pluronic F-127 раствор. Выполняют разведение в шкафу биобезопасности.
Храните как 1%, так и 5% Pluronic F-127 при комнатной температуре. Покрытие 6-скважинной плиты. Автоклавный модуль из нержавеющей стали, кольцо PDMS и пинцет перед использованием.
Выполняйте все последующие процедуры в капюшоне BSC и соблюдайте асептические методы для обеспечения стерильности. Поместите кольцо PDMS в 6-ти ямку с помощью пинцетка. Используйте внешний край кольца PDMS, чтобы выровнять кольцо PDMS концентрически внутри скважины.
Обратите внимание, что следует использовать только хорошо обработанные культурой пластины, не обработанные культурой тканей. Поместите модуль из нержавеющей стали поверх кольца PDMS с помощью пинцета. Вставьте кончики плоскогубцев внутреннего стопорного кольца в захватные трюмы стопорного кольца.
Сожмите держатель, чтобы уменьшить диаметр стопорного кольца. Поместите его в 6-ячную скважину, плотно прижмите его к модулю из нержавеющей стали и отпустите плоскогубцы, чтобы закрепить кольцо PDMS в скважине. Добавьте один мил пять микрограмм на микролитр фибронектина в центр или край скважины, в зависимости от интересующей области, через открытие кольца PDMS и модуля из нержавеющей стали.
Закрутите пластину, чтобы раствор фибронектина охватывал всю интересуемую область. Инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах в увлажненный инкубатор под 95% воздуха и 5% CO2. Удалите раствор фибронектина из колодца.
А теперь дважды помыться PBS. После этого полностью извлеките PBS из колодца. Извлеките из колодца стопорное кольцо, модуль из нержавеющей стали и кольцо PDMS.
Добавьте в скважину 1,5 мил 1% Pluronic F-127 и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы пассивировать поверхность без покрытия. Извлеките раствор Pluronic F-127 из колодца и трижды промойте PBS. После мытья немедленно используйте хорошо покрытый или храните при четырех градусах до двух недель со слоем PBS в покрытом колодце.
Посев эндотелиальных клеток. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и помейте 180 000 клеток в покрытую 6-скважинную пластину в 1,5 мил предварительно теплой клеточной культурной среды. Встряхните пластину колодца сбоку, чтобы ячейки равномерно распределяли в колодец.
Оставьте его в 37-градусном увлажненный инкубатор под 95% воздуха и 5% CO2 на ночь. Применение напряжения сдвига с помощью орбитального шейкера. Клетки должны достичь слияния после трех дней роста.
Замените среду 1,9 мил предварительной клеточной культурной среды для достижения высоты двух миллиметров. Поместите пластину колодца на платформу орбитального шейкера в увлажненный инкубатор и вращайте ее при 150 оборотах в минуту в течение трех дней. Необязательно, после двух дней сдвига, цитокины могут быть добавлены в среду клеточной культуры для исследования взаимодействия между цитокинами и явным стрессом.
После лечения срежют клетки еще на один день. В этом исследовании TNF-альфа использовался для активации клеток. Выполните анализ после трех дней применения напряжения сдвига.
Изображения микроскопа показывают, что Pluronic F-127 предотвращал адгезию HUVEC к области без фибронектинового покрытия. К той части поверхности скважины, которая не была предварительно обработана фибронектином до пассивации Pluronic F-127 после 24 часов роста, на рисунке А, и 72 часов, на рисунке С, не было прикреплено HUVEC. Без пассивации Pluronic F-127 HUVEC были прикреплены к поверхности без фибронектина через 24 часа после посева, на рисунке B, и размножаются дальше на 72 часа, на рисунке D. Шкала равна 500 микрометрам.
Ядерное красное пятно показывает морфологию стриженых HUVEC, A, в центре, и B, на краю полного колодца. Шкала шкалы равна ста микрометрам. A и B также показывают клеточные очертания, очерченные иммуноокрашиванием ZO-1.
Обратите внимание на выравнивание и удлинение ячеек по краю, но не по центру. Он не показывает существенной разницы в индексе ядерной формы, указывающей на округлость, между HUVEC, выращенными в полном объеме, и сегментированными скважинами, которые были замечены для необработанных или обработанных TNF-альфа HUVEC. Клетки были более вытянутыми у края колодца.
Тенденция к большему удлинению в ХУВЕКах, обработанных ФНО-альфа, не была последовательно значимой в разных местах. Не наблюдалось существенной разницы между полными и сегментированными скважинами в плотности A, необработанных, и B, TNF-альфа-обработанных HUVEC в разных радиальных местах. В обоих случаях на единицу площади на краю было больше ячеек, чем в центре скважины.
В заключение, метод, который мы изложили здесь, позволяет выращивать клетки только в одной области закрученного колодца или даже любой системы клеточных культур на основе пластика. Это означает, что клетки в одной части скважины, испытывающие один тип потока, не подвержены влиянию медиаторов, высвобождаемых из клеток в другой области, испытывающих другие потоки. Мало того, мы можем посмотреть на клетки, выращенные в одной области, с клетками или без клеток, выращиваемых в других регионах.
Это позволяет продемонстрировать эффекты таких растворимых медиаторов. Тестирование воздействия обусловленной среды на наивные клетки позволяет то же самое. Анализируя состояние среды, можно идентифицировать медиаторы.
