Questo protocollo descrive un metodo di rivestimento per limitare la crescita delle cellule endoteliali a una regione specifica di una piastra a 6 po porsi per l'applicazione dello stress trasparente utilizzando il modello dello shaker orbitale. Un modo comune per studiare gli effetti del flusso sull'endotelio è quello di coltura delle cellule endoteliali in placche di coltura multi-pozzo su uno shaker orbitale. Lo shaker orbitale induce un'onda che ruota attorno al pozzo.
Le cellule al centro del pozzo sperimentano il tipo di flussi che si pensa portino all'aterosclerosi. Cellule più vicine al flusso di esperienza del bordo che si pensa sia protettivo. Si presume che le proprietà delle cellule in ogni regione dipendano dalle sollecitazioni che sperimentano.
Tuttavia, c'è un potenziale piano in questa logica. Le cellule endoteliali rilasciano mediatori in modo dipendente dal flusso. Questi mediatori raggiungeranno una concentrazione uniforme nel mezzo vorticoso e quindi influenzeranno le cellule in regioni diverse da quella in cui sono state rilasciate.
Ciò può corrompere o nascondere i veri effetti del taglio sul comportamento delle celle. L'effetto non si limita al sistema di pozzi vorticosi. Può verificarsi anche in modelli semplici, come la camera di flusso della piastra parallela.
Può essere evitato coltivando cellule in una sola parte del sistema. Qui descriviamo metodi per consentire l'adesione cellulare solo al centro o solo ai margini del pozzo vorticoso. Fabbricazione di moduli in acciaio inossidabile.
Fabbricare il modulo in acciaio inossidabile da un acciaio inossidabile di grado 316 secondo un disegno ingegneristico fornito. Stampa 3D su PDM. Preparare un modello CAD 3D di stampi PDM utilizzando SOLIDWORKS in base al disegno ingegneristico fornito.
Esportate il modello CAD in un file STL e importate il file STL in Cura 2.6.2. Sezionare il modello in livelli con una velocità di stampa di 50 millimetri al secondo e una densità di riempimento del 60%Esporta il file come GCode. Caricato su una stampante 3D Ultimaker per la stampa.
Utilizzare acido polilattico come materiale di stampa. Fusione dell'anello PDMS. Mescolare bene la base PDMS e l'agente polimerizzante con il rapporto tra 90,9% base e 9,1% agente polimerizzante.
Versare la soluzione ben miscelata nello stampo stampato in 3D. Rimuovere le bolle in una camera di degassamento sottovuoto. Curarlo per un'ora in una fornace a 80 gradi.
Lasciare raffreddare l'anello PDMS a temperatura ambiente. Quindi rimuovere accuratamente l'anello PDMS stagionato dallo stampo. Preparazione dell'1%Pluronic F-127.
Pesare cinque grammi di Pluronic F-127. Versalo in una bottiglia di vetro. Quindi aggiungere cento milioni di acqua Milli-Q nella bottiglia di vetro.
Ciò fornisce una soluzione F-127 pluronica al 5%.000. Assicurarsi che tutta la polvere Pluronic F-127 sia immersa nell'acqua. Chiudere il tappo e autoclave utilizzando un programma di ciclo di sterilizzazione liquido.
Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima dell'uso. Aggiungere 10 mil di soluzione F-127 pluronica al 5%Pluronic a 40 milioni di acqua Milli-Q autoclavata per realizzare una soluzione F-127 pluronica all'1%.000. Eseguire la diluizione in un cappuccio dell'armadio biosicurezza.
Conservare sia l'1% che il 5%Pluronic F-127 a temperatura ambiente. Rivestimento di piastra a 6 pozzi. Modulo autoclave in acciaio inossidabile, anello PDMS e pinzette prima dell'uso.
Eseguire tutte le procedure successive in una cappa BSC e osservare le tecniche asettiche per garantire la sterilità. Posizionare l'anello PDMS in un po 'di 6 pozzine usando una pinzetta. Utilizzate il bordo esterno dell'anello PDMS per allineare l'anello PDMS concentricamente all'interno del pozzo.
Si noti che devono essere utilizzate solo piastre di pozzo non trattate con coltura tissutale. Posizionare il modulo in acciaio inossidabile sopra l'anello PDMS utilizzando una pinzetta. Inserire le punte delle pinze ad anello di fissaggio interne nelle prese dell'anello di fissaggio.
Spremere il supporto per ridurre il diametro dell'anello di contenimento. Mettilo nel pozzo 6, premilo saldamente sul modulo in acciaio inossidabile e rilascia le pinze per fissare l'anello PDMS nel pozzo. Aggiungere un milione di cinque microgrammi per fibronectina microliter al centro o al bordo del pozzo, a seconda della regione di interesse, attraverso l'apertura dell'anello PDMS e del modulo in acciaio inossidabile.
Ruotare la piastra per garantire che la soluzione di fibronectina copra tutta la regione di interesse. Incubare per 30 minuti a 37 gradi in un incubatore umidificato sotto il 95% di aria e il 5%CO2. Rimuovere la soluzione di fibronectina dal pozzo.
E ora lavare due volte con PBS. Una volta fatto, rimuovere completamente il PBS dal pozzo. Rimuovere l'anello di fissaggio, il modulo in acciaio inossidabile e l'anello PDMS dal pozzo.
Aggiungere 1,5 mil di 1%Pluronic F-127 nel pozzo e incubare per un'ora a temperatura ambiente per passivare la superficie non rivestita. Rimuovere la soluzione Pluronic F-127 dal pozzo e lavare tre volte con PBS. Una volta lavato, utilizzare immediatamente il pozzo rivestito o conservare a quattro gradi per un massimo di due settimane con lo strato di PBS nel pozzo rivestito.
Semina di cellule endoteliali. Contare le cellule usando un emocitometro e seminare 180.000 cellule in una piastra rivestita a 6 po', in 1,5 milioni di mezzo di coltura cellulare pre-caldo. Agitare lateralmente la piastra del pozzo per assicurarsi che le cellule distribuiscano uniformemente nel pozzo.
Lasciarlo in un incubatore umidificato a 37 gradi sotto il 95% di aria e il 5% di CO2 durante la notte. Applicazione di sollecitazione di taglio utilizzando uno shaker orbitale. Le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza dopo tre giorni di crescita.
Sostituire il mezzo con 1,9 mil di mezzo di coltura cellulare pre-avvertibile per raggiungere un'altezza di due millimetri. Posizionare una piastra di pozzo sulla piattaforma di uno shaker orbitale in un incubatore umidificato e ruotarla a 150 giri/min per tre giorni. Facoltative, dopo due giorni di taglio, le citochine possono essere aggiunte al mezzo di coltura cellulare per indagare l'interazione tra citochine e stress pura.
Dopo il trattamento, tagliare le cellule per un altro giorno. In questo studio, il TNF-alfa è stato usato per attivare le cellule. Eseguire l'analisi dopo tre giorni di applicazione della sollecitazione di taglio.
Le immagini al microscopio mostrano che pluronico F-127 impediva l'adesione dell'HUVEC alla regione senza rivestimento di fibronectina. Nessun HUVEC è stato attaccato alla parte della superficie del pozzo che non era stata pretrattata con fibronectina prima della passivazione del Pluronico F-127 dopo 24 ore, nella figura A, e 72 ore, nella figura C, di crescita. Senza passivazione Pluronica F-127, gli HUCOV sono stati attaccati alla superficie senza fibronectina, 24 ore dopo la semina, nella figura B, e sono ulteriormente proliferati di 72 ore, nella figura D.La barra di scala è uguale a 500 micrometri.
La macchia rosso nucleare mostra la morfologia degli HUVEC tranciati, A, al centro, e B, ai margini di un pozzo pieno. La barra di scala è uguale a cento micrometri. A e B mostrano anche i contorni delle cellule delineati dall'immunosottenzione di ZO-1.
Si noti l'allineamento e l'allungamento delle celle sul bordo ma non al centro. Non mostra alcuna differenza significativa nell'indice di forma nucleare, indicando rotondità, tra gli HUVEC coltivati in pieno bene e i pozzi segmentati sono stati osservati per gli HUVEC non trattati o trattati con TNF-alfa. Le cellule erano più allungate vicino al bordo del pozzo.
La tendenza ad un maggiore allungamento negli HUVEC trattati con TNF-alfa non era costantemente significativa in tutte le località. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra pozzi pieni e segmentati nel numero di densità di A, non trattato, e B, HUVEC trattati con TNF-alfa in diverse posizioni radiali. In entrambi i casi, c'erano più celle per unità di area sul bordo che al centro del pozzo.
In conclusione, il metodo che abbiamo delineato qui consente di coltivare cellule in una sola regione del pozzo vorticoso o addirittura di qualsiasi sistema di coltura cellulare a base plastica. Ciò significa che le cellule in una parte del pozzo che sperimentano un tipo di flusso non sono influenzate da mediatori rilasciati da cellule in un'altra regione che sperimentano flussi diversi. Non solo, possiamo guardare alle cellule coltivate in una regione con o senza che le cellule vengano coltivate in altre regioni.
Ciò consente di dimostrare gli effetti di tali mediatori solubili. Testare gli effetti del mezzo condizionato sulle cellule ingenue permette la stessa cosa. Analizzando il mezzo di condizione, i mediatori possono essere identificati.
