يجعل تأثير البروتين الراديكالي الهيدروكسيل الخالي من الليزر تحديد مواقع التفاعل البروتيني ومناطق التغيير التأكيدي أسهل بكثير ، مما يسرع الأبحاث في دراسات تجميع البروتين وهيكله واستقراره. مع قياس الجرعات الراديكالي المضمن ، يمكن للمستخدمين ضبط الحمل الراديكالي الهيدروكسيل الفعال في الوقت الفعلي ، ومع قياس الجرعات الراديكالي في الوقت الحقيقي ، يمكنك توفير الوقت التجريبي والعينة الثمينة مع تحسين قابلية التكرار. للبدء، يلتصق 250 ميكرومتر داخلي السيليكا الشعرية إلى 27 بوصة مع الحجر السيليكا شق، والتحقق من نهايات الشعرية لقطع نظيفة ومستقيمة.
إنشاء نافذتين من طول 15 ملليمتر تقريبا. من الطرف السفلي من الشعرية، وحرق بعيدا طلاء البوليميد 90 ملليمتر لإنشاء نافذة التحلل الضوئي و 225 ملليمتر لنافذة مقياس الجرعات. إدراج الطرف السفلي من الشعرية فقط وراء نهاية مخروطية من الجوز والنمس.
إضافة الشعيرات الدموية إلى الميناء الخامس، تشديد فقط وراء إصبع ضيق مع وجع. قم بإزالة غطاء خلية التحلل الضوئي لوحدة التحلل الضوئي عن طريق سحبه مباشرة ، ثم قم بإزالة القناع المعدني المثبت مغناطيسيا ، والذي سيمسك الشعيرات الدموية في مكانها. افتح خلية مقياس الجرعات عن طريق الضغط على علامة التبويب على اليسار وتأرجح خلية مقياس الجرعات المفتوحة إلى اليمين.
إزالة مقاطع محمولة مغناطيسيا التي من شأنها أن تعقد الشعرية في مكان. ثم ضع الشعرية في القناة المخدودة في قاعدة خلية التحلل الضوئي ، وتمركز النافذة الشعرية مع نافذة خلية التحلل الضوئي. عقد الشعرية في الموقف وإضافة القناع المغناطيسي.
ضع غطاء التحلل الضوئي مرة أخرى في موضعه. ضع الشعيرات الدموية في القناة المخدودة في قاعدة خلية الجرعات ، وتمركز النافذة الشعرية الثانية على الفتحة الصغيرة في وسط خلية مقياس الجرعات. في حين عقد الشعرية في موقف بيد واحدة، وضع اثنين من مقاطع المغناطيسي في موقف لعقد الشعرية في مكان.
أغلق الخلية مقياس الجرعات حتى النقر فوق مغلق. وأخيرا، أدخل الشعرية من خلال مقبض knurled فوق رفع الشعرية من جامع المنتج، وتوسيع الشعرية إلى أعلى الجزء السفلي من القارورة. قطع الطول المطلوب من أنابيب تفلون باستخدام القاطع والتحقق من نهايات لقطع مستقيم نظيفة.
إدراج نهاية واحدة من حلقة حقن جديدة من خلال واحدة من المكسرات، ووضع فيرول جديدة على نهاية الأنبوب. عقد الجوز والنمس في مكان أثناء إدخال الأنبوب في ميناء ستة من صمام الحقن حتى قيعان بها. تشديد الجوز مع وجع، ثم تأكد من أن الجوز والنمس هي آمنة في مكان.
مرة واحدة كلا طرفي الجوز والمعادن الثابتة، المسمار فضفاضة نهاية واحدة إلى ميناء ثلاثة والطرف الآخر إلى ميناء ستة. مرة واحدة في الموقف، وتشديد كلا الجانبين إلى إصبع ضيق، ثم ربع بدوره الاصبع الماضي ضيق مع وجع. قم بتشغيل نظام HRPF الخالي من الليزر من خلال بدء تشغيل وحدة fluidics ، تليها وحدة التحلل الضوئي ، وحدة قياس الجرعات ، جامع المنتج ، وكمبيوتر النظام.
تشغيل برنامج النظام. غمر الأنبوب بالكامل إلى 10 ملليلترات من العازلة من وضع الصمام على مضخة الحقنة. توجيه الأنابيب من وضع النفايات والأنابيب من الميناء الثاني على منفذ الحقنة إلى حاوية فارغة لجمع النفايات.
ضع أنابيب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيق في الموضع الذي تم وضع علامة HN6 عليه. شطف خارج حلقة الحقن خمس مرات عن طريق حقن 25 ميكرولتر من الماء HPLC الصف مع صمام تعيين إلى موقف الحمل. قم بتشغيل صمام الحقن يدويا لطرد بقية النظام.
حدد عملية على برنامج التحكم لبدء تدفق المياه حتى تتشكل قطرة. جعل الحل الذي يحتوي على اثنين من الأدينين الميليمولار و 10 بروتين ميكرومولار. ثم جعل محلول إخماد باستخدام 0.3 ملليغرام لكل كاتالاز ملليلتر و 35 ملليمولار ميثياين أميد.
Aliquot 25 ميكرولتر من محلول إخماد في أنبوب صغير 200 ميكرولتر. تمييع بيروكسيد الهيدروجين إلى 200 ملليمولار، وإبقائه على الجليد. بدء الجهد فلاش في صفر فولت على برنامج التحكم.
هذا التحكم صفر فولت ستحدد أي أكسدة الخلفية على البروتين من الفائدة. حدد بدء تشغيل البيانات AutoZero، متبوعا بعملية ثم جاهز. وأخيرا، قم بتحويل صمام الحقن إلى موضع التحميل.
ضع محلول التبريد في الموضع الأول على دائري جامع المنتج ، ثم قم بتغيير قارورة المنتج إلى واحدة على برنامج التحكم في النظام. قبل الحقن مباشرة، اخلط 12.5 ميكرولتر من خليط الأدينين والبروتين مع 12.5 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط، ثم تدور بسرعة عليه.
حقن 25 ميكرولتر من هذا الحل باستخدام منفذ الحقن في غضون 10 ثانية من الاختلاط. قم بتبديل صمام الحقن إلى موضع الحقن وانتظر أثناء معالجة العينة. بدوره تصل الجهد فلاش إلى 750 فولت على برنامج التحكم، وتكرار خطوات وضع العلامات.
ثم سجل امتصاص كل عينة. أولا، انقر فوق تحديد، ثم حدد بداية ونهاية امتصاص الذروة يدويا. في المساحة المتوفرة، اكتب وصفا للعينة.
كرر ذلك لجميع البيانات المكتسبة. نسخ ولصق البيانات في جدول بيانات لحساب متوسط التغير في امتصاص أدينين لكل جهد. بعد جمع جميع العينات، طرد منفذ الحقنة وحلقة العينة عن طريق وضع صمام الحقن وصولا الى موقف الحمل وحقن 25 ميكرولتر من المياه HPLC خمس مرات.
قم بتشغيل صمام الحقن حتى موضع الحقن لطرد بقية النظام بماء HPLC. مسح مرة واحدة، ووقف تدفق، والخروج من برنامج التحكم في النظام، وإيقاف تشغيل وحدات، بدءا من جامع المنتج، وحدة الجرعات، وحدة التحلل الضوئي، وأخيرا وحدة fluidics. عند الأكسدة، يقلل الأدينين المستخدم لقياس الجرعات في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 265 نانومتر.
يحتوي المخزن المؤقت 2 على زبال جذري، مما يقلل من التغير في امتصاص الأدينين مقارنة بالمخزن المؤقت 1. تم تعديل Apomyoglobin في وجود بيروكسيد الهيدروجين والاديدين في أربعة الفولتية مصباح البلازما المتزايد. تم الكشف عن ستة الببتيدات، مع زيادة خطية في الأكسدة فيما يتعلق بتغيير امتصاص الأدينين في 265 نانومتر.
هذه الببتيدات الستة المؤتأكسدة توصف على بنية بلورية من الميوجلوبين. مدى الأكسدة التي تم الكشف عنها من مصباح البلازما الضغط العالي هو أعلى بكثير من طريقة الليزر القائم. تنشأ هذه الزيادة من الطيف العريض لانبعاثات الأشعة فوق البنفسجية لمصباح البلازما عالي الضغط.
من خلال إنتاج طيف واسع للأشعة فوق البنفسجية ، يتداخل مصباح البلازما عالي الضغط بشكل أفضل مع مجال امتصاص بيروكسيد الهيدروجين ، مما يؤدي إلى إنتاج أكثر كفاءة لجذور الهيدروكسيل من خلال التحلل الضوئي لبيروكسيد الهيدروجين ، مقارنة بالليزر Kr F Excimer و Nd YAG Laser. يزيد مصباح البلازما عالي الضغط بشكل كبير من إنتاج الجذور الهيدروكسيلية بما يتجاوز ما يلاحظ عادة باستخدام ليزر Kr F Excimer. يمكن أن يسبب استخدام بيروكسيد 100 ملليمولار مستويات عالية من أكسدة الخلفية.
إذا كان نظام البروتين عرضة للأكسدة الناجمة عن البيروكسيد، تقليل التركيز إلى أقل من 10 ملليمولار. تسمية HRPF لا رجعة فيه يسمح للتعامل مع عينة المصب، بما في ذلك الهضم بروتياز طويلة، يمكنك إضافة في علامة كتلة جنبا إلى جنب لتعدد، وأداء الكروماتوغرافيا 2D، كل تحسين الكشف عن الببتيد والمعلومات الهيكلية concoordinate.
