L'impronta proteica dei radicali idrossilici senza laser rende molto più semplice identificare i siti di interazione proteica e le regioni di cambiamento confermazionale, accelerando la ricerca negli studi di aggregazione, struttura e stabilità delle proteine. Con la dosimetria radicale in linea, gli utenti possono regolare il carico efficace di radicali idrossilici in tempo reale e, con la dosimetria radicale in tempo reale, è possibile risparmiare tempo sperimentale e campione prezioso migliorando al contempo la riproducibilità dell'etichettatura. Per iniziare, scindere un capillare di silice di diametro interno di 250 micrometri a 27 pollici con una pietra di taglio della silice, controllando le estremità del capillare per un taglio pulito e dritto.
Creare due finestre di circa 15 millimetri di lunghezza. Dall'estremità inferiore del capillare, bruciare via il rivestimento in poliimmide 90 millimetri fino a creare la finestra di fotolisi e 225 millimetri per la finestra del dosimetro. Inserire l'estremità inferiore del capillare appena oltre l'estremità conica di un dado e di un ferrule.
Aggiungere il capillare alla porta cinque, stringendo appena oltre il dito stretto con una chiave inglese. Rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi del modulo di fotolisi tirandolo direttamente fuori, quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente, che terrà il capillare in posizione. Aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra.
Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione. Quindi posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella di fotolisi e centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenere il capillare in posizione e aggiungere la maschera magnetica.
Riposizionare il cappuccio della fotolisi. Posizionare il capillare nel canale scanalato alla base della cella del dosimetro e centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della cella del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione.
Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso. Infine, inserire il capillare attraverso la manopola zigrinata in cima al sollevatore capillare del collettore del prodotto, estendendo il capillare appena sopra il fondo del flaconcino. Tagliare la lunghezza desiderata dei tubi in teflon utilizzando una fresa e controllare le estremità per un taglio dritto pulito.
Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il dado e il ferrule in posizione mentre si inserisce il tubo nella porta sei della valvola di iniezione fino a quando non si es verso l'alto. Stringere il dado con una chiave inglese, quindi confermare che il dado e il ferrule sono saldamente in posizione.
Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta tre e l'altra estremità alla porta sei. Una volta in posizione, stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi un quarto girare oltre il dito stretto con una chiave inglese. Accendere il sistema HRPF senza laser avviando il modulo fluidico, seguito dal modulo di fotolisi, dal modulo dosimetro, dal raccoglitore di prodotti e dal computer di sistema.
Avviare il software di sistema. Immergere completamente i tubi in 10 millilitri di tampone dalla posizione della valvola sulla pompa della siringa. Dirigere i tubi dalla posizione dei rifiuti e i tubi dalla porta due sulla porta della siringa verso un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti.
Posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 millilitri nella posizione contrassegnata con HN6 sul carosello del collettore di prodotto. Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 microlitri di acqua di grado HPLC con la valvola impostata sulla posizione di carico. Ruotare manualmente la valvola di iniezione per sciacquare il resto del sistema.
Selezionare Processo sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua fino a quando non si forma una goccia. Creare una soluzione contenente due adenine millimolare e 10 proteine micromolari. Quindi fare una soluzione di tempra usando 0,3 milligrammi per millilitro catalasi e 35 millimolare ammide di metina.
Aliquot 25 microlitri di soluzione di tempra in un microtubo da 200 microlitri. Diluire il perossido di idrogeno a 200 millimolare, mantenendolo sul ghiaccio. Avviare la tensione flash a zero volt sul software di controllo.
Questo controllo a volt zero determinerà qualsiasi ossidazione di fondo sulla proteina di interesse. Selezionare Avvia controllo automatico dati, seguito da Processo e quindi Pronto. Infine, abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.
Posizionare la soluzione di tempra in posizione uno sul carosello del collettore di prodotto, quindi cambiare il flaconcino del prodotto in uno sul software di controllo del sistema. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 microlitri della miscela di adenina e proteine con 12,5 microlitri di perossido di idrogeno. Pipettare la miscela su e giù per mescolare, quindi ruotarla rapidamente verso il basso.
Iniettare 25 microlitri di questa soluzione utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione. Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione. Alzare la tensione flash a 750 volt sul software di controllo e ripetere i passaggi di etichettatura.
Quindi registrare l'assorbanza di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio.
Ripeti questo per tutti i dati acquisiti. Copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione. Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 microlitri di acqua HPLC cinque volte.
Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC. Una volta lavato, arrestare il flusso, uscire dal software di controllo del sistema e spegnere i moduli, a partire dal raccoglitore di prodotti, dal modulo dosimetro, dal modulo di fotolisi e infine dal modulo fluidico. Dopo l'ossidazione, l'adenina utilizzata per la dosimetria diminuisce nell'assorbanza UV a 265 nanometri.
Il buffer 2 contiene uno spazzino radicale, che riduce la variazione dell'assorbanza dell'adenina rispetto al Buffer 1. L'apomioglobina è stata modificata in presenza di perossido di idrogeno e adenina a quattro crescenti tensioni della lampada al plasma. Sono stati rilevati sei peptidi, con un aumento lineare dell'ossidazione rispetto al cambiamento dell'assorbanza dell'adenina a 265 nanometri.
Questi sei peptidi ossidati sono etichettati su una struttura cristallina di mioglobina. L'estensione dell'ossidazione rilevata dalla lampada al plasma ad alta pressione è molto più alta del metodo basato su laser. Questo aumento deriva dall'ampio spettro di emissione UV della lampada al plasma ad alta pressione.
Producendo un ampio spettro UV, la lampada al plasma ad alta pressione si sovrappone meglio al dominio di assorbanza del perossido di idrogeno, risultando in una produzione più efficiente di radicali idrossilici attraverso la fotolisi del perossido di idrogeno, rispetto al laser Kr F Excimer e al laser Nd YAG. La lampada al plasma ad alta pressione aumenta significativamente la produzione di radicali idrossilici oltre a quanto si osserva tipicamente utilizzando un laser Kr F Excimer. L'uso di perossido di 100 millimolare può causare alti livelli di ossidazione dello sfondo.
Se il sistema proteico è suscettibile all'ossidazione indotta dal perossido, ridurre la concentrazione fino a 10 millimolare. L'etichetta irreversibile di HRPF consente la gestione a valle del campione, comprese le lunghe digestione della proteasi, è possibile aggiungere tag di massa tandem per il multiplexing ed eseguire la cromatografia 2D, il tutto migliorando il rilevamento peptidico e le informazioni strutturali coordinate.
