טביעת רגל של חלבונים רדיקליים הידרוקסיל ללא לייזר הופכת את זיהוי אתרי אינטראקציית החלבון והאזורים של שינוי אישור לקל הרבה יותר, ומאיץ את המחקר במחקרי צבירת חלבונים, מבנה ויציבות. עם דוזימטריה רדיקלית מוטבעת, משתמשים יכולים להתאים את העומס הרדיקלי הידרוקסיל יעיל בזמן אמת, ועם דוזימטריה רדיקלית בזמן אמת, אתה יכול לחסוך זמן ניסיוני מדגם יקר תוך שיפור תיוג רבייה. כדי להתחיל, בקע נימי סיליקה בקוטר פנימי 250 מיקרומטר ל 27 אינץ 'עם אבן בקע סיליקה, בדיקת הקצוות של נימי לחתוך נקי וישר.
צור שני חלונות באורך של כ- 15 מ"מ. מהקצה התחתון של נימי, לשרוף את ציפוי פולימיד 90 מילימטרים עד כדי ליצור את החלון photolysis ו 225 מילימטרים עבור חלון dosimeter. הכנס את הקצה התחתון של נימי רק מעבר לקצה חרוט של אגוז פרול.
מוסיפים את נימי ליציאה חמש, הידוק רק מעבר לאצבע חזק עם מפתח ברגים. הסר את כובע התא photolysis של מודול photolysis על ידי משיכת אותו ישר החוצה, ולאחר מכן להסיר את מסכת מתכת רכוב מגנטית, אשר יחזיק את נימי במקום. פתח את תא הדוזימטר על-ידי דחיפת הלשונית משמאל והנפת תא הדוזימטר פתוח לימין.
הסר את הקליפים המותקנים מגנטית שיחזיקו את נימי במקום. לאחר מכן הניחו את נימי לתוך הערוץ מחורץ בבסיס תא photolysis, ומרכז את החלון נימי עם חלון תא photolysis. מחזיקים את נימי בעמדה ומוסיפים את המסכה המגנטית.
הנח את מכסה הפוטוליזה בחזרה בעמדה. מניחים את נימי לתוך הערוץ החריץ בבסיס תא הדוזימטר, ומרכזים את החלון הנימי השני על הצמצם הקטן במרכז תא הדוזימטר. תוך החזקת נימי בעמדה ביד אחת, מניחים את שני הקליפים המגנטיים בעמדה להחזיק את נימי במקום.
סגור את תא הדוזימטר עד שילחץ על סגור. לבסוף, הכנס את נימי דרך הידית ידית ידית על גבי להרים נימי של אספן המוצר, הרחבת נימי רק מעל החלק התחתון של הבקבוקון. חותכים את האורך הרצוי של צינורות טפלון באמצעות חותך ולבדוק את הקצוות עבור חתך ישר נקי.
הכנס קצה אחד של לולאת ההזרקה החדשה דרך אחד האגוזים, ומניחים פרול חדש על קצה הצינור. החזק את האגוז ואת ferrule במקום תוך החדרת הצינור ביציאה שש של שסתום ההזרקה עד שהוא לתחתית החוצה. הדק את האגוז עם מפתח ברגים, ולאחר מכן לאשר כי האגוז ואת ferrule הם בבטחה במקום.
ברגע שלשני הקצוות יש אגוז ופרולה קבועה, בורג רופף בקצה אחד ליציאה שלוש והקצה השני ליציאה שש. לאחר בעמדה, להדק את שני הצדדים לאצבע חזק, ואז רבע להפוך את האצבע בעבר חזק עם מפתח ברגים. הפעל את מערכת HRPF ללא לייזר על-ידי הפעלת מודול Fluidics, ואחריו מודול הפוטוליזה, מודול הדוזימטר, אספן המוצר ומחשב המערכת.
הפעל את תוכנת המערכת. שקוע לחלוטין את הצינור לתוך 10 מיליליטר של חיץ מעמדת השסתום על משאבת המזרק. כוון את הצינור מתנוחת הפסולת ואת הצינור מנמל 2 בנמל המזרק למכל ריק לאיסוף פסולת.
מניחים צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר במיקום מסומן HN6 על קרוסלה אספן המוצר. יש לשטוף את לולאת ההזרקה חמש פעמים על ידי הזרקת 25 מיקרוליטרים של מים בדרגת HPLC כאשר השסתום מוגדר לתנוחת העומס. באופן ידני להפוך את שסתום ההזרקה כדי לשטוף את שאר המערכת.
בחר תהליך בתוכנת הבקרה כדי להתחיל לזרום מים עד צורות טיפה. הפוך פתרון המכיל שני אדנין מילימולאר ו 10 חלבון micromolar. ואז לעשות פתרון להרוות באמצעות 0.3 מיליגרם לכל קטלאז מיליליטר ו 35 מילימולאר מיתיאנין עמיד.
Aliquot 25 מיקרוליטרים של פתרון להרוות לתוך צינור מיקרו 200 מיקרוליטר. לדלל מי חמצן ל200 מילימולאר, שמירה על הקרח. הפעל את מתח הפלאש באפס וולט בתוכנת הבקרה.
בקרת אפס וולט זו תקבע כל חמצון רקע בחלבון המעניין. בחר הפעל את 'מצב אוטומטי של נתונים', ואחריו 'תהליך' ולאחר מכן 'מוכן'. לבסוף, להפוך את שסתום ההזרקה עד למצב העומס.
הנח את פתרון הרווה במיקום אחד על קרוסלת אספן המוצר, ולאחר מכן שנה את בקבוקון המוצר לאחד בתוכנת בקרת המערכת. מיד לפני ההזרקה, מערבבים 12.5 מיקרוליטרים של תערובת אדנין וחלבון עם 12.5 מיקרוליטרים של מי חמצן. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב, ואז במהירות לסובב אותו.
להזריק 25 microliters של פתרון זה באמצעות יציאת ההזרקה בתוך 10 שניות של ערבוב. החלף את שסתום ההזרקה למצב ההזרקה והמתן בזמן שהדגימה מעובדת. הגבירו את מתח ההבזק ל-750 וולט בתוכנת הבקרה וחזרו על שלבי התיוג.
לאחר מכן רשום את הספיגה של כל דגימה. תחילה, לחץ על בחר ולאחר מכן בחר באופן ידני את ההתחלה והסוף של ספיגת השיא. בשטח הפנוי, כתוב בתיאור של הדוגמה.
חזור על פעולה זו עבור כל הנתונים שנרכשו. העתק והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי לחשב את השינוי הממוצע בספיגת אדנין עבור כל מתח. לאחר כל הדגימות נאספו, לשטוף את יציאת המזרק ואת לולאת מדגם על ידי הגדרת שסתום ההזרקה עד למצב העומס ולהזריק 25 microliters של מים HPLC חמש פעמים.
להפוך את שסתום ההזרקה עד עמדת ההזרקה כדי לשטוף את שאר המערכת עם מים HPLC. לאחר ריקון, לעצור את הזרימה, לצאת תוכנת בקרת המערכת, ולכבות את המודולים, החל אספן המוצר, מודול dosimeter, מודול פוטוליזה, ולבסוף מודול fluidics. לאחר חמצון, אדנין המשמש דוזימטריה פוחתת ספיגת UV ב 265 ננומטר.
חיץ 2 מכיל נבלות קיצוניות, אשר מקטין את השינוי בספיגת אדנין לעומת Buffer 1. אפומיוגלובין שונה בנוכחות מי חמצן ואדנין בארבעה מתחי מנורת פלזמה גוברים. שישה פפטידים זוהו, עם עלייה ליניארית חמצון לגבי השינוי של ספיגת אדנין ב 265 ננומטר.
ששת הפפטידים המחומצנים האלה מסומנים על מבנה גבישי של מיוגלובין. מידת החמצון שזוהתה ממנורה פלזמה בלחץ גבוה הוא הרבה יותר גבוה מאשר השיטה מבוססת לייזר. עלייה זו נובעת ספקטרום פליטת UV ספקטרום רחב של מנורת פלזמה בלחץ גבוה.
על ידי הפקת ספקטרום UV רחב, מנורת פלזמה בלחץ גבוה טוב יותר חופף את תחום הספיגה של מי חמצן, וכתוצאה מכך ייצור יעיל יותר של רדיקלים הידרוקסיל באמצעות הפוטוליזה של מי חמצן, לעומת לייזר Kr F Excimer ו Nd YAG לייזר. מנורת פלזמה בלחץ גבוה מגדילה באופן משמעותי את הייצור של רדיקלים הידרוקסיל מעבר למה שנצפה בדרך כלל באמצעות לייזר Kr F Excimer. באמצעות 100 מי חמצן מילימולאר יכול לגרום לרמות גבוהות של חמצון רקע.
אם מערכת החלבון רגישה חמצון הנגרמת על ידי חמצן, להקטין את הריכוז עד נמוך כמו 10 מילימולאר. התווית הבלתי הפיכה של HRPF מאפשרת טיפול במדגם במורד הזרם, כולל עיכול פרוטאז ארוך, ניתן להוסיף תג מסה דו-מושבי עבור multiplexing, ולבצע כרומטוגרפיה דו-מימדית, כל שיפור זיהוי פפטיד ומידע מבני קונקורדינציה.
