La huella de proteínas de radicales hidroxilo sin láser hace que la identificación de sitios de interacción de proteínas y regiones de cambio de confirmación sea mucho más fácil, acelerando la investigación en estudios de agregación, estructura y estabilidad de proteínas. Con la dosimetría radical en línea, los usuarios pueden ajustar la carga efectiva del radical hidroxilo en tiempo real, y con la dosimetría radical en tiempo real, puede ahorrar tiempo experimental y una muestra preciosa mientras mejora la reproducibilidad del etiquetado. Para comenzar, escinda un capilar de sílice de 250 micrómetros de diámetro interior a 27 pulgadas con una piedra de hendidura de sílice, revisando los extremos del capilar para un corte limpio y recto.
Cree dos ventanas de aproximadamente 15 milímetros de longitud. Desde el extremo inferior del capilar, queme el recubrimiento de poliimida 90 milímetros hacia arriba para crear la ventana de fotólisis y 225 milímetros para la ventana dosimétrica. Inserte el extremo inferior del capilar justo más allá del extremo cónico de una tuerca y una férula.
Añadir el capilar al puerto cinco, apretando justo más allá del dedo apretado con una llave inglesa. Retire la tapa de la celda de fotólisis del módulo de fotólisis tirando de ella directamente hacia fuera, luego retire la máscara de metal montada magnéticamente, que mantendrá el capilar en su lugar. Abra la celda del dosímetro presionando la pestaña de la izquierda y gire la celda del dosímetro abierta hacia la derecha.
Retire los clips montados magnéticamente que mantendrán el capilar en su lugar. Luego coloque el capilar en el canal ranurado en la base de la celda de fotólisis y centre la ventana capilar con la ventana de la celda de fotólisis. Mantenga el capilar en su posición y agregue la máscara magnética.
Vuelva a colocar la tapa de fotólisis en su posición. Coloque el capilar en el canal ranurado en la base de la celda del dosímetro y centre la segunda ventana capilar en la pequeña abertura en el centro de la celda del dosímetro. Mientras mantiene el capilar en posición con una mano, coloque los dos clips magnéticos en posición para mantener el capilar en su lugar.
Cierre la celda del dosímetro hasta que haga clic en cerrar. Finalmente, inserte el capilar a través de la perilla a la parte superior de la elevación capilar del colector de producto, extendiendo el capilar justo por encima de la parte inferior del vial. Corte la longitud deseada de la tubería de teflón con un cortador y compruebe los extremos para un corte recto limpio.
Inserte un extremo del nuevo bucle de inyección a través de una de las tuercas y coloque una nueva férula en el extremo del tubo. Mantenga la tuerca y la férula en su lugar mientras inserta el tubo en el puerto seis de la válvula de inyección hasta que salga de la parte inferior. Apriete la tuerca con una llave inglesa, luego confirme que la tuerca y la férula están firmemente en su lugar.
Una vez que ambos extremos tienen una tuerca y una férula fija, atornille libremente un extremo al puerto tres y el otro extremo al puerto seis. Una vez en posición, apriete ambos lados para apretar el dedo, luego un cuarto de vuelta más allá del dedo apretado con una llave inglesa. Encienda el sistema HRPF sin láser iniciando el módulo de fluídica, seguido del módulo de fotólisis, el módulo dosímetro, el colector de productos y la computadora del sistema.
Inicie el software del sistema. Sumerja completamente el tubo en 10 mililitros de tampón desde la posición de la válvula en la bomba de la jeringa. Dirija el tubo desde la posición de desecho y el tubo desde el puerto dos en el puerto de la jeringa a un contenedor vacío para recoger los desechos.
Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en la posición marcada HN6 en el carrusel del colector de productos. Enjuague el bucle de inyección cinco veces inyectando 25 microlitros de agua de grado HPLC con la válvula configurada en la posición de carga. Gire manualmente la válvula de inyección para enjuagar el resto del sistema.
Seleccione Proceso en el software de control para comenzar a fluir agua hasta que se forme una gota. Haga una solución que contenga dos adeninas milimolares y 10 proteínas micromolares. Luego haga una solución de temple usando 0.3 miligramos por mililitro catalasa y 35 milimolares de methianine amida.
Alícuota 25 microlitros de solución de temple en un micro tubo de 200 microlitros. Diluya el peróxido de hidrógeno a 200 milimolares, manteniéndolo en hielo. Inicie el voltaje del flash a cero voltios en el software de control.
Este control de cero voltios determinará cualquier oxidación de fondo en la proteína de interés. Seleccione Iniciar datos AutoZero, seguido de Proceso y, a continuación, Listo. Finalmente, gire la válvula de inyección hacia abajo a la posición de carga.
Coloque la solución de temple en la posición uno en el carrusel del colector de producto y, a continuación, cambie el vial del producto a uno en el software de control del sistema. Inmediatamente antes de la inyección, mezcle 12,5 microlitros de la mezcla de adenina y proteínas con 12,5 microlitros de peróxido de hidrógeno. Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo para mezclar, a continuación, girar rápidamente hacia abajo.
Inyecte 25 microlitros de esta solución utilizando el puerto de inyección dentro de los 10 segundos de la mezcla. Cambie la válvula de inyección a la posición de inyección y espere mientras se procesa la muestra. Suba el voltaje del flash a 750 voltios en el software de control y repita los pasos de etiquetado.
A continuación, registre la absorbancia de cada muestra. En primer lugar, haga clic en Seleccionar y, a continuación, seleccione manualmente el principio y el final de la absorbancia máxima. En el espacio disponible, escriba una descripción del ejemplo.
Repita esto para todos los datos adquiridos. Copie y pegue los datos en una hoja de cálculo para calcular el cambio promedio en la absorbancia de adenina para cada voltaje. Después de que se hayan recogido todas las muestras, enjuague el puerto de la jeringa y el bucle de la muestra colocando la válvula de inyección en la posición de carga e inyecte 25 microlitros de agua de HPLC cinco veces.
Gire la válvula de inyección hasta la posición de inyección para enjuagar el resto del sistema con agua hplc. Una vez enjuagado, detenga el flujo, salga del software de control del sistema y apague los módulos, comenzando con el colector de producto, el módulo dosímetro, el módulo de fotólisis y, finalmente, el módulo de fluídica. Tras la oxidación, la adenina utilizada para la dosimetría disminuye en la absorbancia UV a 265 nanómetros.
El almacenador intermediario 2 contiene un limpiador radical, que disminuye el cambio en la absorbancia de la adenina comparada al almacenador intermediario 1. Apomyoglobin fue modificado en presencia de peróxido de hidrógeno y de adenina en cuatro voltajes cada vez mayores de la lámpara del plasma. Se detectaron seis péptidos, con un aumento lineal de la oxidación con respecto al cambio de la absorbancia de la adenina a 265 nanómetros.
Estos seis péptidos oxidados están etiquetados en una estructura cristalina de mioglobina. El grado de oxidación detectado en la lámpara de plasma de alta presión es mucho mayor que el método basado en láser. Este aumento surge del amplio espectro de emisión UV de amplio espectro de la lámpara de plasma de alta presión.
Al producir un amplio espectro UV, la lámpara de plasma de alta presión se superpone mejor al dominio de absorbancia del peróxido de hidrógeno, lo que resulta en una producción más eficiente de radicales hidroxilo a través de la fotólisis del peróxido de hidrógeno, en comparación con el láser Kr F Excimer y el láser Nd YAG. La lámpara de plasma de alta presión aumenta significativamente la producción de radicales hidroxilo más allá de lo que normalmente se observa utilizando un láser Kr F Excimer. El uso de peróxido de 100 milimolares puede causar altos niveles de oxidación de fondo.
Si el sistema proteico es susceptible a la oxidación inducida por peróxido, disminuya la concentración hasta 10 milimolaos. La etiqueta irreversible de HRPF permite el manejo de muestras aguas abajo, incluidas las digestiones largas de proteasas, puede agregar una etiqueta de masa en tándem para la multiplexación y realizar cromatografía 2D, todo lo cual mejora la detección de péptidos y concoordina la información estructural.
