A pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser facilita muito a identificação de locais de interação proteica e regiões de mudanças confirmacionais, acelerando a pesquisa em estudos de agregação, estrutura e estabilidade de proteínas. Com a dosimetria radical inline, os usuários podem ajustar a carga radical de hidroxíl eficaz em tempo real, e com a dosimetria radical em tempo real, você pode economizar tempo experimental e amostra preciosa enquanto melhora a reprodutibilidade de rotulagem. Para começar, corte uma capilar de sílica de 250 micrômetros de diâmetro interno até 27 polegadas com uma pedra de fissura de sílica, verificando as extremidades do capilar para um corte limpo e reto.
Crie duas janelas de aproximadamente 15 milímetros de comprimento. Da extremidade inferior do capilar, queime o revestimento de poliimida 90 milímetros para criar a janela de fotolise e 225 milímetros para a janela dosímetro. Insira a extremidade inferior do capilar logo após a extremidade cônica de uma porca e ferrule.
Adicione o capilar à porta cinco, apertando um pouco além do dedo apertado com uma chave inglesa. Remova a tampa celular fotolise do módulo fotolise puxando-a diretamente para fora, em seguida, remova a máscara metálica montada magneticamente, que manterá o capilar no lugar. Abra a célula dosímetro empurrando a aba à esquerda e gire a célula dosímetro aberta para a direita.
Remova os clipes magneticamente montados que manterão o capilar no lugar. Em seguida, coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula fotolise e centralize a janela capilar com a janela da célula fotolíase. Mantenha o capilar em posição e adicione a máscara magnética.
Coloque o boné de fotolise de volta na posição. Coloque o capilar no canal ranhurado na base da célula dosímetro, e centralize a segunda janela capilar na pequena abertura no centro da célula dosímetro. Enquanto segura o capilar em posição com uma mão, coloque os dois clipes magnéticos em posição para manter o capilar no lugar.
Feche a célula dosímetro até que ela clique fechada. Por fim, insira o capilar através do botão amassado sobre o elevador capilar do coletor do produto, estendendo o capilar até um pouco acima da parte inferior do frasco. Corte o comprimento desejado da tubulação Teflon usando um cortador e verifique as extremidades para um corte reto limpo.
Insira uma extremidade do novo laço de injeção através de uma das porcas, e coloque uma nova ferrule na extremidade do tubo. Segure a porca e a ferrula no lugar enquanto insere o tubo na porta seis da válvula de injeção até que ele se desnúde. Aperte a porca com uma chave inglesa e confirme que a porca e a ferrula estão no lugar.
Uma vez que ambas as extremidades tenham uma porca e ferrule fixa, enrosque vagamente uma extremidade para a porta três e a outra extremidade para a porta seis. Uma vez em posição, aperte ambos os lados para o dedo apertado, em seguida, um quarto vire o dedo apertado com uma chave inglesa. Ligue o sistema HRPF sem laser iniciando o módulo fluido, seguido do módulo de fotolise, módulo dosímetro, coletor de produtos e computador do sistema.
Inicie o software do sistema. Submergir totalmente a tubulação em 10 mililitros de tampão da posição da válvula na bomba de seringa. Direcione a tubulação da posição de resíduo e a tubulação da porta dois na porta da seringa para um recipiente vazio para coletar resíduos.
Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro na posição marcada HN6 no carrossel coletor de produtos. Enxágüe o laço de injeção cinco vezes injetando 25 microliters de água de grau HPLC com a válvula definida na posição de carga. Gire manualmente a válvula de injeção para lavar o resto do sistema.
Selecione Processo no software de controle para começar a fluir água até que uma gota se forme. Faça uma solução contendo duas adenina milimães e 10 proteínas micromolar. Em seguida, faça uma solução de saciar usando 0,3 miligramas por catalase mililitro e 35 milimolars de methianina amida.
Aliquot 25 microliters de solução de saciar em um micro tubo de 200 microliteres. Diluir peróxido de hidrogênio para 200 mililitros, mantendo-o no gelo. Inicie a tensão flash a zero volts no software de controle.
Este controle de volts zero determinará qualquer oxidação de fundo na proteína de interesse. Selecione Iniciar dados AutoZero, seguido por Process then Ready. Por fim, vire a válvula de injeção para a posição de carga.
Coloque a solução de saciar na posição um no carrossel coletor de produtos e, em seguida, altere o frasco do produto para um no software de controle do sistema. Imediatamente antes da injeção, misture 12,5 microliters da mistura de adenina e proteína com 12,5 microliters de peróxido de hidrogênio. Pipeta a mistura para cima e para baixo para misturar, em seguida, rapidamente gire-a para baixo.
Injete 25 microliters desta solução usando a porta de injeção dentro de 10 segundos após a mistura. Mude a válvula de injeção para a posição de injeção e espere enquanto a amostra está sendo processada. Apareçam a tensão de flash para 750 volts no software de controle e repita as etapas de rotulagem.
Em seguida, registo a absorvância de cada amostra. Primeiro, clique em Selecionar e selecione manualmente o início e o fim do pico de absorção. No espaço disponível, escreva em uma descrição da amostra.
Repita isso para todos os dados adquiridos. Copie e cole os dados em uma planilha para calcular a variação média da absorvância de adenina para cada tensão. Depois de todas as amostras terem sido coletadas, limpe a porta da seringa e o laço amostral, colocando a válvula de injeção na posição de carga e injete cinco vezes microliters de água HPLC.
Gire a válvula de injeção até a posição de injeção para lavar o resto do sistema com água HPLC. Uma vez lavado, pare o fluxo, saia do software de controle do sistema e desligue os módulos, começando pelo coletor de produtos, módulo dosímetro, módulo de fotolise e, finalmente, o módulo fluido. Após a oxidação, a adenina utilizada para a dosimetria diminui na absorção uv a 265 nanômetros.
O Buffer 2 contém um carniceiro radical, que diminui a mudança na absorção de adenina em comparação com o Buffer 1. A apomyoglobina foi modificada na presença de peróxido de hidrogênio e adenina em quatro tensões crescentes de lâmpadas de plasma. Foram detectados seis peptídeos, com aumento linear da oxidação em relação à mudança da absorção de adenina em 265 nanômetros.
Estes seis peptídeos oxidados são rotulados em uma estrutura cristalina de mioglobina. A extensão da oxidação detectada a partir da lâmpada de plasma de alta pressão é muito maior do que o método baseado em laser. Esse aumento decorre do amplo espectro de emissão UV da lâmpada de plasma de alta pressão.
Ao produzir um amplo espectro UV, a lâmpada plasmática de alta pressão se sobrepõe melhor ao domínio de absorção de peróxido de hidrogênio, resultando em uma produção mais eficiente de radicais hidroxil através da fotolise do peróxido de hidrogênio, em comparação com o Kr F Excimer Laser e Nd YAG Laser. A lâmpada de plasma de alta pressão aumenta significativamente a produção de radicais hidroxil além do que é normalmente observado usando um Laser Kr F Excimer. O uso de peróxido de 100 milimônios pode causar altos níveis de oxidação de fundo.
Se o sistema proteico é suscetível à oxidação induzida por peróxido, diminua a concentração para até 10 mililitros. O rótulo irreversível do HRPF permite o manuseio de amostras a jusante, incluindo digestões longas de protease, você pode adicionar em conjunto etiqueta de massa para multiplexação, e realizar cromatografia 2D, todas melhorando a detecção de peptídeos e informações estruturais concoordenadas.
