هذا البروتوكول يجعل من الممكن للتلاعب البروتينات، أو التعبير ميكرورنا، في الخلايا الدهنية المتمايزة لدراسة دورها في وظيفة الخلايا الدهنية. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لتحويل أوليغونوكليوتيدات إلى خلايا 3T3-L1 الماوس. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الخلايا قبل الديبادية البشرية المتمايزة في الخلايا الدهنية.
إثبات الإجراء سيكون ميلاني غاودفرين، فني من مختبرنا. تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملليمتر في DMEM دون بيروفاتي، 25 ميليمولار الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين. ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية وسبعة في المئة من ثاني أكسيد الكربون.
بعد يومين من التقاء, تغيير المتوسطة الثقافة, استبداله مع DMEM دون بيروفاتي, 25 جلوكوز ملليمولار, 10٪FCS, وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين تكملها 0.25 ملليمولار IBMX, 0.25 ميكرومولار ديكساميثازون, خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر الأنسولين, و 10 rosiglitazone ميكرومولار. احتضان الأطباق لمدة يومين. بعد يومين، استبدل الوسط الثقافي ب DMEM بدون بيروفاتي، و25 ميليمولار جلوكوز، و10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستربتوميسين المكمل بخمسة ميكروجرامات لكل ملليلتر من الأنسولين و10 ميكرومولار روزيجليتازون واحتضان لمدة يومين آخرين.
إطعام الخلايا كل يومين مع DMEM دون بيروفاتي، 25 جلوكوز ملليمولار، 10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين والحفاظ على الخلايا في الحاضنة. قبل يوم أو بضع ساعات من عملية العدوى، قم بإعداد محلول من نوع الكولاجين الأول بمعدل 100 ميكروغرام لكل ملليلتر في 30٪ إيثانول من محلول مخزون بمعدل ملليلتر واحد لكل ملليلتر. إضافة 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من لوحة 12 بئرا أو 125 ميكرولتر لكل بئر من لوحة 24 بئرا ونشر الحل على سطح البئر.
اترك الطبق بدون الغطاء تحت غطاء الثقافة حتى يجف الكولاجين. ثم غسله مرتين مع برنامج تلفزيوني مد. ماصة siRNA مع تحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية لخلط واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
إضافة كاشف transfection وتحسين الحد الأدنى من الوسط الأساسي إلى siRNA وماصة لخلط. احتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف مزيج العدوى إلى كل بئر من الطبق المغلف بالكولاجين.
غسل الخلايا في طبق بيتري 100 ملليمتر مرتين مع D-PBS. إضافة 5x تريبسين إلى الخلايا، مع التأكد من تغطية السطح بأكمله مع تريبسين. انتظر لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية التريبسين.
احتضان طبق بيتري لمدة خمس إلى عشر دقائق في 37 درجة مئوية في الحاضنة. ثم اضغط على الطبق لفصل الخلايا، وتجنب تلف الخلايا. إضافة 10 ملليلتر من DMEM دون بيروفاتي, 25 جلوكوز ملليمولار, 10٪FCS, وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين لتحييد تريبسين.
ماصة بعناية المتوسط صعودا وهبوطا لفصل الخلايا وتجانس تعليق الخلية. عد الخلايا باستخدام غرفة عد Malassez أو عداد الخلية الآلي وضبط تركيز الخلايا إلى 0.625 مليون خلية لكل ملليلتر من المتوسط. البذور 800 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 12 جيدا أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر من لوحة 24 جيدا تحتوي على مزيج العدوى.
احتضان لوحات في حاضنة ثقافة الخلية وعدم إزعاج لهم لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدال بعناية supernatant مع DMEM الطازجة دون بيروفاتي، 25 جلوكوز ملليمولار، 10٪FCS، وواحد في المئة البنسلين والستريبتوميسين والعودة الخلايا إلى الحاضنة. النقاط الزمنية النموذجية للكشف عن ضربة قاضية الهدف بعد تسليم سيرنا أو مير هي 24 إلى 48 ساعة لرنا و 48 إلى 96 ساعة للبروتين.
يمكن إجراء التجارب الوظيفية على الخلايا الدهنية المصابة بما في ذلك إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، إفراز أديبوكين ، انحلال الدهون ، وتولد الدهون. وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بعد العدوى. بعد يومين من العدوى ، قدمت الخلايا الدهنية قطرات الدهون متعددة الخلايا مع محتوى الدهون لا يختلف بين الخلايا الدهنية المصابة وغير المصابة.
لم يتغير تعبير مرنا لعلامات التمايز المختلفة في الخلايا المتحولة مقارنة بالخلايا الدهنية غير المصابة. بروتوكول العدوى العكسية فعال حيث تم تحويل أكثر من 70٪ من الخلايا الدهنية. بعد ثلاثة أيام من العدوى مع سيرنا ضد بيريليبين-1، انخفض مستوى الحمض النووي الريبي من بيريليبين-1 بنسبة 70٪، كما تم تحليل مستوى البروتين بنسبة 63٪ Perilipin-1 التعبير عن طريق المجهر الفلوري بعد أربعة أيام من العدوى وتبين أن انخفض بنسبة 92٪ مقارنة مع تعبيره في الخلايا الدهنية السيطرة.
يظهر هنا عكس العدوى من الخلايا الدهنية مع الحمض النووي الريبي الدقيق محاكاة oligonucleotides لتنظيم ما يصل التعبير عن مير-34a. أدى الإفراط في التعبير عن miR-34a إلى انخفاض في التعبير البروتيني VAMP2 بنسبة 50٪ أدت الضربة القاضية ل Perilipin-1 في 3T3-L1 adipocytes إلى زيادة في انحلال الدهون القاعدية في حين أدى الإفراط في التعبير عن miR-34a إلى تثبيط بروتين كيناز B الفوسفورية الناجم عن الأنسولين وإقبال الجلوكوز. من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز adipocytes لأداء العدوى على الخلايا الدهنية المتمايزة حديثا ورصد بعناية علاج الخلايا الدهنية مع التريبسين.
بعد العدوى، فمن الممكن لإجراء تجارب وظيفية على الخلايا الدهنية لدراسة تأثير البروتينات أو التلاعب ميكرورنا على إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، تكوين الدهون، وانحلال الدهون.
