Dieses Protokoll ermöglicht es, Proteine oder microRNA-Expression in differenzierten Adipozyten zu manipulieren, um ihre Rolle in der Funktion von Adipozyten zu untersuchen. Diese Reverse-Transfektionsmethode ist eine einfache, wirtschaftliche und hocheffiziente Methode zur Transfektierung von Oligonukleotiden in Maus-3T3-L1-Adipozyten. Diese Methode kann auch auf menschliche Präadipozyten angewendet werden, die in Adipozyten differenziert sind.
Demonstriert wird das Verfahren von Melanie Gaudfrin, einer Technikerin aus unserem Labor. Züchten Sie die 3T3-L1-Fibroblasten in 100-Millimeter-Schalen in DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% neugeborenes Kälberserum und ein Prozent Penicillin und Streptomycin. Stellen Sie das Geschirr in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und sieben Prozent Kohlendioxid.
Wechseln Sie zwei Tage nach dem Zusammenfluss das Kulturmedium und ersetzen Sie es durch DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% FCS und ein Prozent Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 0,25 Millimolar IBMX, 0,25 mikromollarem Dexamethason, fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin und 10 mikromolarem Rosiglitazon. Inkubieren Sie das Geschirr für zwei Tage. Zwei Tage später ersetzen Sie das Kulturmedium durch DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% FCS und ein Prozent Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin und 10 mikromolaren Rosiglitazon und inkubieren Sie für weitere zwei Tage.
Füttern Sie die Zellen alle zwei Tage mit DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% FCS und einem Prozent Penicillin und Streptomycin und halten Sie die Zellen im Inkubator. Bereiten Sie einen Tag oder einige Stunden vor der Transfektion eine Lösung von Kollagen Typ I bei 100 Mikrogramm pro Milliliter in 30% Ethanol aus einer Stammlösung zu einem Milligramm pro Milliliter vor. Fügen Sie 250 Mikroliter Kollagen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte oder 125 Mikroliter pro Well einer 24-Well-Platte hinzu und verteilen Sie die Lösung über die Oberfläche des Brunnens.
Lassen Sie die Platte ohne Deckel unter der Kulturhaube, bis das Kollagen trocknet. Dann zweimal mit D-PBS waschen. Pipetten Sie die siRNA mit einem verbesserten minimalen essentiellen Medium zum Mischen und Inkubieren für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Fügen Sie das Transfektionsreagenz und das verbesserte minimale essentielle Medium zur siRNA hinzu und pipetten Sie es zu mischen. Inkubieren Sie es für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dann fügen Sie die Transfektionsmischung zu jeder Vertiefung der kollagenbeschichteten Platte hinzu.
Waschen Sie die Zellen in der 100 Millimeter Petrischale zweimal mit D-PBS. Fügen Sie 5x Trypsin zu den Zellen hinzu und achten Sie darauf, die gesamte Oberfläche mit dem Trypsin zu bedecken. Warten Sie 30 Sekunden und entfernen Sie das Trypsin vorsichtig.
Die Petrischale fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius im Inkubator inkubieren. Tippen Sie dann auf die Schüssel, um die Zellen zu lösen und Zellschäden zu vermeiden. Fügen Sie 10 Milliliter DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% FCS und ein Prozent Penicillin und Streptomycin hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
Pipetten Sie das Medium vorsichtig nach oben und unten, um die Zellen zu lösen und die Zellsuspension zu homogenisieren. Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zählkammer oder einem automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellen auf 0,625 Millionen Zellen pro Milliliter Medium ein. Säen Sie 800 Mikroliter der Zellsuspension pro Vertiefung einer 12-Well-Platte oder 400 Mikroliter der Zellsuspension pro Well einer 24-Well-Platte, die die Transfektionsmischung enthält.
Inkubieren Sie die Platten in einem Zellkultur-Inkubator und stören Sie sie 24 Stunden lang nicht. Ersetzen Sie am nächsten Tag vorsichtig den Überstand durch frisches DMEM ohne Pyruvat, 25 Millimolarglukose, 10% FCS und ein Prozent Penicillin und Streptomycin und bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. Typische Zeitpunkte für den Nachweis des Ziel-Knockdowns nach siRNA- oder miR-Abgabe sind 24 bis 48 Stunden für mRNA und 48 bis 96 Stunden für Protein.
Funktionelle Experimente können an transfizierten Adipozyten durchgeführt werden, einschließlich Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Adipokinsekretion, Lipolyse und Lipogenese. Es wurde gezeigt, dass die Adipozyten ihre Morphologie nach der Transfektion bewahren. Zwei Tage nach der Transfektion präsentierten die Adipozyten multilokulare Lipidtröpfchen mit einem Lipidgehalt, der sich zwischen den transfizierten und nicht transfizierten Adipozyten nicht unterschied.
Die mRNA-Expression verschiedener Differenzierungsmarker war in transfizierten Zellen im Vergleich zu der in nicht transfizierten Adipozyten unverändert. Das Reverse-Transfektionsprotokoll ist effizient, da mehr als 70% der Adipozyten transfiziert wurden. Drei Tage nach der Transfektion mit siRNA gegen Perilipin-1 war der mRNA-Spiegel von Perilipin-1 um 70% gesunken und der Proteinspiegel um 63% Perilipin-1-Expression wurde auch vier Tage nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert und es wurde festgestellt, dass er im Vergleich zu seiner Expression in Kontrolladipozyten um 92% abgenommen hatte.
Die Umgekehrttransfektion von Adipozyten mit microRNA, die Oligonukleotide nachahmt, um die Expression von miR-34a hochzuregulieren, wird hier gezeigt. Die Überexpression von miR-34a führte zu einer Abnahme der VAMP2-Proteinexpression um 50%Der Knockdown von Perilipin-1 in 3T3-L1-Adipozyten führte zu einer Zunahme der Basallipolyse, während die Überexpression von miR-34a zur Hemmung der insulininduzierten Proteinkinase B-Phosphorylierung und Glukoseaufnahme führte. Es ist wichtig, ein hohes Maß an Adipozytendifferenzierung zu erreichen, um die Transfektion an neu differenzierten Adipozyten durchzuführen und die Behandlung von Adipozyten mit Trypsin sorgfältig zu überwachen.
Nach der Transfektion ist es möglich, funktionelle Experimente an den Adipozyten durchzuführen, um den Einfluss von Proteinen oder microRNA-Manipulation auf Die Insulinsignalisierung, Glukoseaufnahme, Lipogenese und Lipolyse zu untersuchen.
