פרוטוקול זה מאפשר לתפעל חלבונים, או ביטוי מיקרו-רנ"א, באדיפוציטים מובחנים כדי לחקור את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להעביר אוליגונוקלאוטידים לאדיפוציטים של עכבר 3T3-L1. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על preadipocytes אנושיים מובחנים אדיפוציטים.
מי שתדגים את ההליך תהיה מלאני גודפרין, טכנאית מהמעבדה שלנו. לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מילימטר ב- DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, סרום עגל שזה עתה נולד, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין. מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות ב 37 מעלות צלזיוס ושבעה אחוז פחמן דו חמצני.
יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף אותו עם DMEM ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 מילימטר IBMX, 0.25 מיקרומולר דקסמתזון, חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר, ו 10 מיקרומולר רוזיגליטזון. לדגור על הכלים במשך יומיים. יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת חמישה מיקרוגרם לאינסולין מיליליטר ו 10 מיקרומולר רוזיגליצון ודגרה במשך יומיים נוספים.
להאכיל את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולרי, 10%FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולשמור על התאים באינקובטור. יום אחד או כמה שעות לפני ההדבקה, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם למיליליטר ב 30% אתנול מפתרון מלאי במיליגרם אחד למיליליטר. הוסיפו 250 מיקרוליטרים של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות או 125 מיקרוליטרים לבאר של צלחת של 24 בארות ומפזרים את הפתרון על פני השטח של הבאר.
השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. ואז לשטוף אותו פעמיים עם D-PBS. מזלפים את siRNA עם בינוני חיוני מינימלי משופר לערבב ודגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
מוסיפים את ריאגנט הטרנס-זיהום ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א ופיפטה לערבב. לדגור אותו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מוסיפים את תערובת הטרנספקטיון לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.
לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף טריפסין 5x לתאים, הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 שניות והסיר בזהירות את טריפסין.
לדגור את צלחת פטרי במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור. לאחר מכן הקש על המנה כדי לנתק את התאים, תוך הימנעות מנזק לתא. הוסף 10 מיליליטר של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ואחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין כדי לנטרל את טריפסין.
בזהירות pipette המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא. לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי ולהתאים את הריכוז של התאים ל 0.625 מיליון תאים למיליליטר של בינוני. זרע 800 מיקרוליטרים של השעיית התא לבאר של צלחת 12-well או 400 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת 24-באר המכילה את תערובת transfection.
לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים ולא להפריע להם במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, גלוקוז 25 מילימולר, 10% FCS, ו אחוז אחד פניצילין וסטרפטומיצין ולהחזיר את התאים לאינקובטור. נקודות זמן אופייניות לזיהוי נוקאאוט יעד לאחר מסירת siRNA או miR הן 24 עד 48 שעות עבור mRNA ו 48 עד 96 שעות לחלבון.
ניסויים פונקציונליים יכולים להתבצע על אדיפוזיטים transfected כולל איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, lipolysis, ליפוגנזה. אדיפוציטים הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection. יומיים לאחר transfection, adipocytes הציג טיפות שומנים רב לשוניות עם תוכן שומנים לא שונה בין אדיפוזיטים transfected ולא transfected.
ביטוי ה- mRNA של סמני בידול שונים לא השתנה בתאים שהודבקו בהשוואה לזה של אדיפוציטים שאינם מושפעים. פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הוא יעיל כמו יותר מ -70% של adipocytes הועברו. שלושה ימים לאחר הטרנספקט עם siRNA נגד Perilipin-1, רמת ה- mRNA של Perilipin-1 ירדה ב -70%ורמת החלבון ב -63%ביטוי Perilipin-1 נותחה גם על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ארבעה ימים לאחר ההדבקה ונמצא כי ירדה ב -92% בהשוואה לביטוי שלה באדיפוציטים שליטה.
טרנס-טרנספקט של אדיפוציטים עם מיקרו-רנ"א המחקה אוליגונוקלאוטידים כדי לווסת את הביטוי של miR-34a מוצג כאן. ביטוי יתר של miR-34a הוביל לירידה בביטוי חלבון VAMP2 על ידי 50%ההשבתה של Perilipin-1 ב 3T3-L1 אדיפוזיטים הוביל לעלייה ליפוליזה בזאלית בעוד ביטוי יתר של miR-34a הוביל לעיכוב של חלבון המושרה באינסולין קינאז B זרחן וספיגת גלוקוז. חשוב להגיע לרמה גבוהה של הבחנה אדיפוציטים כדי לבצע את transfection על אדיפוציטים מובחנים חדשים כדי לפקח בזהירות על הטיפול של אדיפוציטים עם טריפסין.
לאחר ההדבקה, ניתן לבצע ניסויים פונקציונליים על אדיפוזיטים כדי לחקור את ההשפעה של חלבונים או מניפולציה microRNA על איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipogenesis, ליפוליזה.
