이 프로토콜은 단백질, 또는 microRNA 발현을 분화한 아디포사이클로 조작하여 백혈구 기능에서 그들의 역할을 연구할 수 있게 합니다. 이 역형 형질 법은 마우스 3T3-L1 선포세포로 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 방법은 또한 adipocytes로 분화된 인간 적인 지방세포에 적용될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 멜라니 고드프린 (Melanie Gaudfrin)이 될 것입니다. 3T3-L1 섬유아세포는 Pyruvate없이 DMEM에서 100 밀리미터 요리, 25 밀리머 포도당, 10 %의 신생아 송아지 혈청, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술을 재배하십시오. 요리는 37섭씨 37도, 이산화탄소 7%에 티슈 배양기인에 놓습니다.
합류 이틀 후, 배양 배지를 변경, 피루바테없이 DMEM으로 교체, 25 밀리머 포도당, 10%FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 상감 균주 보충 0.25 밀리머 IBMX, 0.25 마이크로 모라 dexamethasone, 0.25 마이크로 그램, 밀리리터 인슐린 당 5 마이크로 그램, 및 10 마이크로 그램. 2 일 동안 요리를 배양하십시오. 이틀 후, 피루바테없이 DMEM으로 배양 배지를 대체, 25 밀리모어 포도당, 10%FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 상미신은 밀리리터 인슐린 당 5 마이크로 그램과 10 마이크로 몰러 rosiglitazone 및 인큐베이트 2 일 동안 보충.
피루바테, 25 밀리머 포도당, 10 %FCS, 1 % 페니실린과 연쇄상 구균증없이 DMEM으로 이틀마다 세포를 공급하고 인큐베이터에 세포를 유지합니다. 1일 또는 몇 시간 전에, 밀리리터 당 100 마이크로그램에서 콜라겐 타입 I의 용액을 밀리리터당 1밀리그램의 스톡 용액에서 30%에탄올로 준비합니다. 24웰 플레이트의 웰당 12웰 플레이트 또는 125 마이크로리터당 250마이크로리터의 콜라겐을 넣고 우물 표면에 용액을 퍼놓습니다.
콜라겐이 건조 될 때까지 배양 후드 아래에 뚜껑없이 접시를 둡니다. 그런 다음 D-PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양할 수 있는 최소한의 필수 매체가 개선된 siRNA 파이펫.
스페션 시약과 개선된 최소한의 필수 매체를 siRNA 및 파이펫에 추가하여 혼합합니다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션을 드시면 됩니다. 그런 다음 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 형질 혼합물을 추가합니다.
D-PBS로 100mm 페트리 접시에 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 5배 트립신을 세포에 추가하여 트립신으로 전체 표면을 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 트립신을 조심스럽게 제거합니다.
인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5~10분 동안 페트리 요리를 배양합니다. 그런 다음 접시를 탭하여 세포를 분리하여 세포 손상을 피하십시오. 피루바테 없이 DMEM의 10 밀리리터를 추가, 25 밀리머 포도 당, 10%FCS, 1% 페니실린과 연쇄상 구균 트립신을 중화.
세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화하기 위해 배지를 위아래로 조심스럽게 피펫합니다. 말라세즈 카운팅 챔버 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 세포의 농도를 매체의 밀리리터 당 0.625,000 세포로 조절한다. 종자 800 마이크로리터는 12웰 플레이트 또는 400 마이크로리터의 세포 현탁액당 24웰 플레이트의 질당 경질 혼합물을 함유하고 있다.
세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양하고 24 시간 동안 방해하지 마십시오. 다음 날, 조심스럽게 피루바테없이 신선한 DMEM으로 상체를 교체, 25 밀리몰러 포도당, 10 %FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술, 인큐베이터에 세포를 반환. siRNA 또는 miR 전달 후 표적 녹다운을 검출하기 위한 일반적인 시간 점은 mRNA를 위해 24 48시간 및 단백질에 대한 48-96시간입니다.
기능적 실험은 인슐린 신호, 포도당 섭취, 아디포크인 분비, 리포시스 및 리포발생을 포함한 전감염된 지방세포에서 수행될 수 있다. 대신구는 형질 전환 후 그들의 형태를 보존하기 위하여 표시되었습니다. 2일 후, 형포세포는 지질 함량이 있는 다중 지질 방울을 트랜스페드및 비감염성 세포 사이에 다르지 않다는 것을 제시했습니다.
다양한 분화 마커의 mRNA 발현은 비감염된 세포에 비해 전과된 세포에서 변하지 않았다. 역순환 프로토콜은 비도세포의 70% 이상이 전염됨에 따라 효율적입니다. 페리핀-1에 대한 siRNA를 통한 트랜스페션 후 3일 후, 페리리핀-1의 mRNA 수준은 70% 감소했으며, 단백질 수준은 63%로 감소했으며, 또한 형광 현미경검사법에 의해 분석되었으며, 대조군발의 발현에 비해 92% 감소한 것으로 나타났다.
miR-34a의 발현을 최대 조절하기 위해 올리고뉴클레오티드를 모방한 마이크로RNA를 통한 선포세포의 역형이 여기에 나와 있다. miR-34a의 과발현은 VAMP2 단백질 발현의 감소를 50%까지 감소시켰으며, 3T3-L1 분광구에서 페리핀-1의 녹다운은 기저리폴리시스의 증가로 이어졌고 miR-34a의 과발현은 인슐린 유발 단백질 키나제 Bphosphyl 의 억제로 이어졌다. 새로 분화된 아디포세포에 대한 트랜스페션을 수행하고 트립신을 사용하여 아디포세포의 처리를 주의 깊게 모니터링하기 위해 높은 수준의 지방세포 분화에 도달하는 것이 중요합니다.
트랜스펙트 에 이어, 인슐린 신호, 포도당 섭취량, 리포제네시스 및 리폴리시스에 대한 단백질 또는 마이크로RNA 조작의 영향을 연구하기 위해 대각선에 대한 기능적 실험을 수행할 수 있다.
