Bu protokol, adipositler işlevindeki rollerini incelemek için proteinleri veya mikroRNA ekspresyonunu farklılaştırılmış adipositlerde manipüle etmeyi mümkün kılar. Bu ters transfeksiyon yöntemi, oligonükleotidleri fare 3T3-L1 adipositlerine geçirmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntem, adipositlere farklılaştırılmış insan preadipositlerine de uygulanabilir.
Prosedürü gösteren melanie Gaudfrin, laboratuvarımızdan bir teknisyen. 3T3-L1 fibroblastlarını DMEM'de 100 milimetrelik yemeklerde piruvat, 25 milimolar glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan yetiştirin. Bulaşıkları 37 santigrat derecede ve yüzde yedi karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.
Bir araya geldikten iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, yerine piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz, % 10 FCS ve 0,25 milimoler IBMX, 0,25 mikromoler deksametazon, milimetre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazone ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin kullanın. Bulaşıkları iki gün kuluçkaya yatır. İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve mililitre insülin başına beş mikrogram ve 10 mikromoler rosiglitazon ile desteklenmiş yüzde bir penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve iki gün daha kuluçkaya yatırın.
Hücreleri her iki günde bir dmem ile piruvatsız, 25 milimolar glikoz, %10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin ve hücreleri inkübatörde tutun. Transfeksiyondan bir gün veya birkaç saat önce, mililitre başına bir miligramda bir stok çözeltisinden% 30 etanolde mililitre başına 100 mikrogramda bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 mikrolitre kollajen veya 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 mikrolitre ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.
Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Daha sonra D-PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca karıştırmak ve kuluçkaya yatırmak için geliştirilmiş minimum esansiyel ortama sahip siRNA pipeti.
Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş minimal esansiyel ortamı karıştırmak için siRNA ve pipete ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır. Daha sonra transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her kuyusuna ekleyin.
100 milimetre Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin, tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsinleri dikkatlice çıkarın.
Petri kabını inkübatörde 37 santigrat derecede beş ila 10 dakika kuluçkaya bırakın. Ardından hücreleri ayırmak için çanağa dokunun ve hücre hasarını önlayın. Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 mililitre DMEM, 25 milimolar glikoz, % 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisin ekleyin.
Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı boruya takın. Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu mililitre orta başına 0.625 milyon hücreye ayarlayın. 12 kuyulu bir plakanın kuyusu başına hücre süspansiyonunun 800 mikrolitresini veya transfeksiyon karışımını içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 400 mikrolitre hücre süspansiyonunu tohumlayın.
Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırın ve 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvat, 25 milimoler glikoz,% 10 FCS ve yüzde bir penisilin ve streptomisinin olmadan taze DMEM ile dikkatlice değiştirin ve hücreleri inkübatöre geri verin. SiRNA veya miR teslimatından sonra hedef devirmeyi tespit etmek için tipik zaman noktaları mRNA için 24 ila 48 saat ve protein için 48 ila 96 saattir.
İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez dahil olmak üzere transfected adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapılabilir. Adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, adipositler transfected ve transfected olmayan adipositler arasında farklı olmayan lipid içeriğine sahip çok damarlı lipit damlacıkları sundular.
Çeşitli farklılaşma belirteçlerinin mRNA ekspresyasyonu transfected hücrelerde transfected olmayan adipositlere kıyasla değişmedi. Ters transfeksiyon protokolü, adipositlerin %70'inden fazlası transkraklı olduğu için etkilidir. Perilipin-1'e karşı siRNA ile transfeksiyondan üç gün sonra Perilipin-1'in mRNA seviyesi %70, protein seviyesi ise %63 Perilipin-1 ekspresyonu transeksiyondan dört gün sonra floresan mikroskopi ile analiz edilmiş ve kontrol mezhebislerindeki ifadesine göre %92 oranında azaldığı tespit bulunmuştur.
MiR-34a ekspresyonunu yukarı düzenlemek için mikroRNA taklit eden oligonükleotidler ile adipositlerin ters transfeksiyonları burada gösterilmiştir. MiR-34a'nın aşırı ekspresyonu VAMP2 protein ekspresyonunun %50 azalmasına yol açtı Perilipin-1'in 3T3-L1 adipositlerinde devrilmesi bazal lipolizde artışa yol açarken, miR-34a'nın aşırı ekspresyonu insülin kaynaklı protein kinaz B fosforilasyonunun ve glikoz alımının inhibisyonuna yol açtı. Yeni farklılaştırılmış adipositler üzerinde transfeksiyon gerçekleştirmek ve tripin ile adipositlerin tedavisini dikkatle izlemek için yüksek düzeyde adiposit farklılaşmasına ulaşmak önemlidir.
Transfeksiyondan sonra, proteinlerin veya mikroRNA manipülasyonunun insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz üzerindeki etkisini incelemek için adipositler üzerinde fonksiyonel deneyler yapmak mümkündür.
