هذا هو البروتوكول الأول الذي يسمح لأنسجة الثدي البشرية للحفاظ على الحياة في الجسم الحي السابق لفترات طويلة من الزمن مما يسمح مباشرة لدراسة التفاعلات بين أنسجة الثدي البشري وسرطان الثدي البشري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقطع مجهرية من أنسجة الثدي البشري بما في ذلك خلايا الثدي ، والخلايا المناعية ، وهياكل الأوعية الدموية ، والهياكل اللاصقة والمصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الحياة في الجسم الحي السابق. هذه التقنية لها آثار كبيرة على عدة مجالات من أبحاث سرطان الثدي بما في ذلك الطب الشخصي، والتنمية الصيدلانية والفيزيولوجيا المرضية لبدء الورم وأبطأ عمليات سرطان الثدي مثل التليف وإعادة عرض مصفوفة خارج الخلية.
مما يدل على هذا الإجراء هي كاثرين هيبرت، طالبة الدراسات العليا تولين وراكيش غورالا طالب الطب تولين من مختبري. للبدء، تذوب محلول الجيلاتين المعدة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدام ماصة المصلية خمسة أو 10 ملليلتر للاستغناء عن 2.5 ملليلتر من هذا الحل على كل المكبس لل آبار من لوحة بئر ستة.
بمجرد أن يتماسك الجيلاتين ، حرك لوحات ASC المشفرة pNIPAAm إلى خزانة السلامة الحيوية. وضع بلطف المكبس في آبار هذه الصفائح بحيث الجيلاتين الاتصالات ASCs. ضع غسالة معدنية على المكبس لوزنها بحيث يكون الجيلاتين على اتصال مباشر مع ورقة ASC لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تحرك بلطف لوحة مع المكبس في مربع معقمة في خزانة السلامة الحيوية ووضع الغطاء على ذلك. نقل مربع إلى ثلاجة أربع درجات أو وضع لوحة على الجليد ودلو الثلج في خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة. في خزانة السلامة الحيوية، اغسل أنسجة الثدي البشري ثلاث مرات بعشرة ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم.
استخدام ملقط معقمة وشفرة حلاقة لفرم بخشونة قبل الميلاد-MPS ومحاولة لإزالة أكبر قدر ممكن من اللفافة والأنسجة الضامة. مرة واحدة تمت إزالة النسيج الضام استخدام شفرة حلاقة معقمة لفرم أخيرا الأنسجة حتى يكون لها اتساق السائل متجانسة. قطع غيض من طرف ماصة P1000 للمساعدة في pipetting الأنسجة المفروم.
في أنبوب 1.5 ملليلتر، اجمع بين الأنسجة المفرومة وخطوط الخلايا السرطانية ووسائط BC-MPS كما هو موضح في المخطوطة النصية. نقل لوحة ACS التي سيتم استخدامها للوحة الخلية السفلية من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية وتنشق الوسائط من اللوحة. ماصة خليط أنسجة الثدي المعدة على وسط بئر لوحة ACS السفلي باستخدام تلميح ماصة قطع، نقل مربع يحتوي على لوحة ACS العلوي مع المكبس إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية.
إزالة بلطف المكبس الجيلاتين من لوحة المغلفة pNIPAAm ووضعها على رأس خليط الأنسجة. إضافة BC-MPS وسائل الإعلام إلى البئر وتحريك لوحات ACS أسفل بعناية مع خليط BC-MPS والغطاسات إلى مربع البلاستيك العقيم. ضع غطاء الصندوق للنقل ، مع الحرص على تجنب تلوث الثقافة.
احتضان لوحة أسفل في المربع وحاضنة 37 درجة مئوية حتى يذوب الجيلاتين وطبقة ACS الأعلى قد بدأت في الالتزام الطبقة السفلية. ثم نقل مربع مع لوحات لمجلس الوزراء السلامة الحيوية، وإزالة بلطف المكبس من لوحات أسفل لمراقبة الأنسجة مع الخلايا السرطانية الراسية إلى الجزء السفلي من البئر. ضع غطاء اللوحة ذات الست آبار مرة أخرى على اللوحة السفلية واحتضنها عند 37 درجة لإذابة الجيلاتين تماما والسماح للطبقة العليا بالإرساء في الطبقة السفلية.
نقل لوحات بلطف إلى خزانة السلامة الحيوية وتنشق وسائل الإعلام من حافة البئر مع ماصة المصلية 10 ملليلتر. إضافة اثنين من ملليلتر من وسائل الإعلام الطازجة على حافة كل بئر لتجنب إزاحة الأنسجة. الحفاظ على BC-MPS في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للطول المطلوب من الزمن.
تغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام. نقل لوحة لمجلس الوزراء السلامة الحيوية عندما تكون جاهزة لتحليلها قبل الميلاد- MPS. إزالة الوسائط مع ماصة المصلية لتجنب إزاحة عرضي من أي أنسجة.
إضافة مجلد واحد من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. ثم إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة المصلية. أضف ملليلتر واحد من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر ونقل اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة خمس دقائق للسماح لهذه الخلايا بالفصل.
بعد الحضانة، استخدم مكشطة الخلايا لفصل الخلايا والأنسجة تماما عن لوحة الثقافة في خزانة السلامة الحيوية. نقل الحل مع الأنسجة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وجمع أي خلايا المتبقية عن طريق إضافة اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني. التفاف أنبوب مع رقائق الألومنيوم إذا كانت الخلايا الفلورية.
احتضان الأنبوب في 37 درجة تحت التحريض المستمر في شاكر المدارية في مرة واحدة G لمدة 10 إلى 20 دقيقة لنأي الخلايا تماما من الأنسجة. في خزانة السلامة الحيوية، استخدم ماصة مصلية لتعطيل أي كتل متبقية من الخلايا في الأنبوب. وتصفية العينة من خلال مصفاة الأنسجة 250 متر صغير في أنبوب جديد 15 ملليلتر.
شطف مصفاة مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لجمع أي الخلايا المتبقية. الطرد المركزي العينات في 500 مرة ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا الدهنية التي سوف تطفو في الطبقة العليا من الخلايا السرطانية و ASCs مختلطة معا في بيليه. نقل طبقة adipocyte إلى أنبوب جديد باستخدام طرف ماصة قطع حادة.
طرد مركزي العينة مرة أخرى واستخدام حقنة وإبرة لإزالة المحلول المتبقي من أسفل الخلايا الدهنية. يستنشق المحلول المتبقي من الأنبوب الذي يحتوي على ASCs والخلايا السرطانية دون تعطيل بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام PBS أو BC-MPS واستخدام قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا على أساس مضان.
يظهر هنا النمط المدعوم من stri لصحيفة ASC التقاء. كان نسيج الثدي البشري المزدهر لا يزال مستقرا مثبتا بصفائح خلايا ASC إلى أسفل البئر بعد 14 يوما من الثقافة. صور المجهر الفلورسنت إظهار استقرار BC-MPS مع MDA-MB-231 التعبير عن خطوط الخلية RFP بعد 14 يوما ومع الورم السلبي الثلاثي explant PDX لمدة ستة أيام على الأقل.
BC-MPS التي تحتوي على أنسجة الثدي كانت مزرعة في المختبر لمدة 14 يوما، ملطخة وصورة لإظهار العناصر الأصلية للأنسجة في 100X و 20X التكبير. تم استخدام تلطيخ علامات الضامة لإظهار الحفاظ على الضامة الأولية بعد ثلاثة وسبعة أيام في الثقافة. تدفق تحليل قياس الخلايا من Bodipy الملون MDA-MB-231 الخلايا بعد 14 يوما تشير إلى الحد الأدنى من تراكم الدهون في الثقافة 2D وتراكم الدهون واسعة وBC-MPS.
وكانت نسبة الخلايا الإيجابية الدهون MDA-MB-231 26.2 أضعاف في BC-MPS من الثقافة 2D. الخلايا المستزرعة في BC-MPS عرض زيادة قطرات الدهون بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة في الثقافة 2D القياسية. وأظهرت صور الفاصل الزمني ل RFP المسمى BC-MPS مع خلايا MDA-MB-231 حركة الأميبويد من 231 خلية مع القرون الزائفة والحركة العالية.
يجب أن تكون أنسجة الثدي مفرومة صغيرة بما يكفي وفصلها بما يكفي لتوزيعها عبر الجزء السفلي من البئر. أنسجة الثدي مزدهرة جدا، وإذا كانت القطع كبيرة جدا أو متجمعة بشكل وثيق جدا معا، فإن أوراق الخلية ASC لن تكون قادرة على ترسيخ أنسجة الثدي إلى الجزء السفلي من البئر. يمكن أن يخضع سرطان أنسجة الثدي الناتج عن ذلك لعملية هضم أنزيمية لعزل أنواع معينة من الخلايا ذات الاهتمام.
سيسمح هذا بالإجابة على الأسئلة الرئيسية مثل كيفية استجابة الخلايا السرطانية في أنسجة الثدي بشكل مختلف للعلاج الكيميائي مقارنة بالثقافة التقليدية 2D أو الأجهزة العضوية.
