Este é o primeiro protocolo que permite que o tecido mamário humano seja mantido vivo ex vivo por períodos prolongados de tempo permitindo diretamente o estudo das interações entre tecido mamário humano e câncer de mama humano. A principal vantagem dessa técnica é que permite que pedaços macroscópicos do tecido mamário humano, incluindo adipócitos mamários, células imunes, estruturas vasculares, estruturas ductais e matriz extracelular sejam mantidos vivos ex vivo. Essa técnica tem grandes implicações para diversas áreas da pesquisa sobre câncer de mama, incluindo medicina personalizada, desenvolvimento farmacêutico e fisiopatologia de iniciação tumoral e processos mais lentos de câncer de mama, como fibrose e remodelação da matriz extracelular.
Demonstrando este procedimento estão Katherine Hebert, uma estudante de pós-graduação de Tulane e Rakesh Gurrala uma estudante de medicina tulane do meu laboratório. Para começar, derreta a solução de gelatina preparada em um banho de água de 37 graus Celsius. Use uma pipeta sorológica de cinco ou 10 mililitros para distribuir 2,5 mililitros desta solução em cada êmbolo para poços de uma placa de seis poços.
Uma vez que a gelatina tenha se solidificado, mova as placas ASC codificadas pNIPAAm para o armário de biosegurança. Coloque delicadamente os êmbolos nos poços dessas placas para que a gelatina entre em contato com as ASCs. Coloque uma arruela metálica no êmbolo para pesá-la para que a gelatina esteja em contato direto com a folha ASC por 30 minutos em temperatura ambiente.
Mova suavemente a placa com os êmbolos para dentro da caixa estéril no armário de biosegurança e coloque a tampa sobre ela. Mova a caixa para uma geladeira de quatro graus ou coloque a placa no gelo e um balde de gelo no armário de biosegurança por 30 minutos. Em um armário de biosegurança, lave o tecido mamário humano três vezes com 10 mililitros de PBS estéreis.
Use fórceps estéreis e uma lâmina de barbear para cortar grosseiramente o BC-MPS e tentar remover o máximo de fáscia e tecido conjuntivo possível. Uma vez que o tecido conjuntivo tenha sido removido use uma lâmina de barbear estéril para finalmente picar o tecido até que tenha uma consistência líquida homogênea. Corte a ponta de uma ponta de pipeta P1000 para ajudar na pipetação do tecido picado.
Em um tubo de 1,5 mililitro, combine o tecido mince, as linhas celulares cancerígenas e a mídia BC-MPS, conforme descrito no manuscrito do texto. Mova a placa ACS que será usada para a folha de célula inferior da incubadora para o gabinete de biosegurança e aspire a mídia da placa. Pipeta a mistura de tecido mamário preparada no centro do poço da placa ACS inferior usando a ponta de pipeta cortada, mova a caixa contendo a placa ACS superior com êmbolos para o armário de biosegurança.
Remova suavemente os êmbolos de gelatina da placa revestida pNIPAAm e coloque-os em cima da mistura de tecido. Adicione a mídia BC-MPS ao poço e mova cuidadosamente as placas ACS inferiores com a mistura BC-MPS e os desentupidores para a caixa de plástico estéril. Coloque a tampa da caixa para o transporte, tomando cuidado para evitar a contaminação da cultura.
Incubar a placa inferior na caixa e na incubadora de 37 graus Celsius até que a gelatina seja derretida e a camada acs superior tenha começado a aderir à camada inferior. Em seguida, mova a caixa com as placas para o armário de biosegurança, remova suavemente os êmbolos das placas inferiores para observar o tecido com as células cancerígenas ancoradas na parte inferior do poço. Coloque a tampa da placa de seis poços de volta na placa inferior e incubar a 37 graus para derreter completamente a gelatina e permitir que a camada superior ancore até a camada inferior.
Mova suavemente as placas para um armário de biosegurança e aspire a mídia da borda do poço com uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Adicione dois mililitros de mídia fresca na borda de cada poço para evitar desalojar o tecido. Mantenha o BC-MPS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono pelo tempo desejado.
Mudando a mídia a cada dois ou três dias. Mova a placa para o gabinete de biosegurança quando o BC-MPS estiver pronto para ser analisado. Remova a mídia com uma pipeta sorológica para evitar a desalojadeira acidental de qualquer tecido.
Adicione um volume de PBS a cada poço. Em seguida, remova o PBS com uma pipeta sorológica. Adicione um mililitro da solução de dissociação celular a cada poço e mova a placa de volta para a incubadora por cinco minutos para permitir que essas células se desprendem.
Após a incubação, use um raspador de células para desprender completamente as células e o tecido da placa de cultura em um armário de biosegurança. Transfira a solução com o tecido para um tubo cônico de 15 mililitros e colete todas as células restantes adicionando dois mililitros de PBS. Enrole o tubo com papel alumínio se as células estiverem fluorescentes.
Incubar o tubo a 37 graus sob agitação constante em um agitador orbital a uma hora G por 10 a 20 minutos para dissociar completamente as células do tecido. Em um armário de biosegurança, use uma pipeta sorológica para interromper qualquer aglomerado restante de células no tubo. E filtrar a amostra através de um coador de tecido de 250 mímetros em um novo tubo de 15 mililitros.
Enxágüe o coador com um mililitro de PBS para coletar quaisquer células restantes. Centrifugar as amostras a 500 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos para separar os adipócitos que estarão flutuando na camada superior das células cancerosas e ASCs misturados em uma pelota. Transfira a camada de adipócito para um novo tubo usando uma ponta de pipeta de corte sem corte.
Centrifugar a amostra novamente e usar uma seringa e uma agulha para remover a solução restante de baixo dos adipócitos. Aspire a solução restante do tubo contendo as ASCs e células cancerosas sem interromper a pelota celular. Suspenda a pelota na mídia PBS ou BC-MPS e use citometria de fluxo para classificar as células com base na fluorescência.
O padrão stri-aided da folha ASC confluente é mostrado aqui. O tecido mamário humano flutuante ainda estava estável ancorado pelas folhas celulares ASC até o fundo do poço após 14 dias de cultura. Imagens de microscopia fluorescente demonstram a estabilidade do BC-MPS com mda-MB-231 expressando linhas celulares RFP após 14 dias e com o triplo tumor negativo explantar PDX por pelo menos seis dias.
BC-MPS contendo tecido mamário foi cultivado in vitro por 14 dias, manchado e imagem para demonstrar os elementos nativos do tecido em 100X e 20X de ampliação. A coloração dos marcadores macrófagos foi utilizada para mostrar a preservação dos macrófagos primários após três e sete dias na cultura. A análise da citometria de fluxo das células MDA-MB-231 manchadas de Bodipy após 14 dias indicam acúmulo mínimo de lipídios na cultura 2D e acúmulo labíduo extenso e BC-MPS.
A proporção de células MDA-MB-231 lipídicas positivas foi 26,2 vezes maior em BC-MPS do que a cultura 2D. Células cultivadas em BC-MPS apresentaram aumento de gotículas lipídicas em comparação com células cultivadas na cultura 2D padrão. Imagens de lapso de tempo de RFP rotuladas bc-mps com células MDA-MB-231 mostraram movimento amoeboid de 231 células com pseudo pods e alta motilidade.
O tecido mamário deve ser picado o suficiente e separado o suficiente para ser distribuído na parte inferior do poço. O tecido mamário é muito flutuante e se as peças forem muito grandes ou agrupadas muito próximas, as folhas celulares ASC não serão capazes de ancorar o tecido mamário na parte inferior do poço. Os construtos resultantes do câncer de tecido mamário podem sofrer digestão enzimática para isolar determinados tipos de interesse celular.
Isso permitirá que perguntas-chave sejam respondidas, como como as células cancerígenas no tecido mamário respondem de forma diferente à quimioterapia em comparação com a cultura 2D tradicional ou organoides.
