خلايا HC11 وEpH4 هي خطوط خلايا ظهارية الماوس التي يمكن أن تفرق في الثقافة. في الوقت نفسه، يمكن تحويل هذه الخلايا من قبل عدد من الـ أونكوجين. هذه الخلايا هي مثالية لدراسة العلاقة المتبادلة بين التمايز والتحول neoplastic.
يمكن استخدام هذه التقنيات في دراسات نقل الإشارات لاكتشاف أهداف لعلاج السرطان. على سبيل المثال، قد تؤدي الـ GTPase Rac الصغيرة والجزيئات الأخرى إلى تحويل خلايا الثدي الظهارية عندما يتم التعبير عنها إلى مستويات عالية، ولكن من المستغرب عند مستويات منخفضة، أنها قد تحفز التمايز. قد يتصرف محولات الإشارة الأخرى بطريقة مماثلة.
المبادئ قد تنطبق على أنواع أخرى من التمايز وكذلك عندما التقاء الخلية يلعب دورا هاما، على سبيل المثال التفريق من adipocytes أو myotubes. يجب أن تضع في اعتبارك أن طلاء خلايا HC11 مهم. وهذا لأن الاتصال من خلية إلى خلية مهم للتمايز.
نقطة أخرى لمشاهدة هو أن استخراج السليم من الخلايا EpH4 من المصفوفة أمر بالغ الأهمية لكمية البروتين لأن أي بقايا سوف تؤثر على تحديد البروتين. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب مفيد لأن بعض تفاصيل البروتوكول يصعب وصفها على الورق. ابدأ بإعداد زجاجة من 50 ملليلتر من HC11 خلية المتوسطة وفقا لاتجاهات المخطوطات.
لطبق الخلايا، وpirate المتوسطة من خمسة ستة سنتيمتر 50٪ التقاء أطباق بيتري وغسل الخلايا مع ما يقرب من 1.8 ملليلتر من التربسين باستخدام القطن تسعة بوصة معقم توصيل الماصات باستور. ثم إضافة 200 ميكرولترات من التربسين في لوحة ودوامة لوحة لإزاحة الخلايا المرفقة. مراقبة الخلايا تحت مرحلة المجهر النقيض مع هدف 4X للتأكد من أنها بدأت في طرد.
ثم تطن تقريبا 1.5 ملليلتر من HC11 المتوسطة مع الماصات تسعة بوصة معقمة باستور وبخ عموديا ضد الخلايا أثناء تدوير الطبق مع التأكد من تجنب الرش. نقل جميع الخلايا إلى زجاجة مع HC11 المتوسطة ودوامة لتفريق بالتساوي في زجاجة. ثم aliquot تعليق الخلية في 20 ثلاثة أطباق بيتري سنتيمتر عن طريق الأنابيب مليلتر اثنين من الخلايا في الطبق الواحد.
صخرة أطباق بيتري لنشر الخلايا واحتضان لهم في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في اليوم التالي عندما تكون الخلايا 90 إلى 100٪ التقاء، التعرق المتوسطة واستبدالها مع المتوسطة مع FBS ولكن من دون EGF. بعد زراعة الخلايا في المتوسط دون EGF لمدة 24 ساعة، إضافة متوسطة التمايز إلى 10 أطباق وتنمو الخلايا لمدة تصل إلى 10 أيام حفظ الأطباق 10 الأخرى كضوابط.
تغيير المتوسطة كل يومين إلى ثلاثة أيام مع كل من خلايا HIP المعالجة والتحكم. لرصد التمايز، لاحظ الخلايا مع المجهر النقيض المرحلة. استخدم المجهر الفلوري إذا كانت الخلايا تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر.
بالإضافة إلى ذلك، كمي درجة التمايز عن طريق استخراج البروتينات من الخلايا المعالجة والسيطرة HIP مرة واحدة في اليوم وإجراء تحليل لطخة الغربية. جمع ووضع متوسط النمو EPH4، ومصفوفة EHS، واثنين من أنابيب 50 ملليلتر مخروطية على الجليد. Prechill لوحات ثقافة الأنسجة مع نصائح ماصة في ناقص 20 درجة مئوية وإعداد EpH4 متوسطة النمو تكملها 10 أو 20٪ مصفوفة في اثنين من أنابيب مخروطية 50 ملليلتر والاحتفاظ بها على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
بعد استرجاع لوحات ثقافة الأنسجة قبل التلهيل في ناقص 20 درجة مئوية، معطف 10 آبار من لوحة 24-جيدا مع 150 ميكرولترات من مصفوفة غير مخففة عن طريق نشر المصفوفة مع ماصة. تجنب خلق فقاعات عند نشر المصفوفة. ثم اضغط بلطف على جانبي اللوحة واحتضان اللوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للمصفوفة لترسيخ.
وفي الوقت نفسه، الاستعداد للتمايز عن طريق التربسينسين الخلايا EpH4 جيدا كما هو موضح سابقا وضمان تعليق خلية واحدة بعد إعادة دمج الخلايا التربسينيه. بعد ذلك، عد الخلايا في التعليق مع جهاز قياس الهيموسيت. نقل خمس مرات 10 إلى الخلايا الأربع في البئر إلى 1.5 ملليلتر أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي معقم وتدور عليها في 250 مرة ز لمدة خمس دقائق.
الطامح بعناية المتوسطة فائقة ووضع الأنبوب على الجليد. استخدام تلميح ماصة ملليلتر واحد لإعادة ضغط الخلايا في 350 ميكرولتررس من متوسطة النمو EpH4 تكملها 20٪ مصفوفة مع الحفاظ على أنابيب على الجليد التأكد من تجنب فقاعات. مرة واحدة في طبقة أسفل قد توطدت، إضافة 350 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل المغلفة جيدا ووضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح 20٪ طبقة مصفوفة لترسيخ.
مراقبة الخلايا مع المجهر النقيض من المرحلة للتأكد من خلايا واحدة مرئية. ثم إضافة 200 ميكرولتررس من EpH4 المتوسطة مع 10٪ مصفوفة على رأس واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية. بدء التمايز التعريفي يوم واحد بعد طلاء الخلايا في المصفوفة.
إزالة بعناية 150 ميكرولتررس من أعلى 10٪ مصفوفة المتوسطة وإضافة 200 ميكرولترات من EpH4 المتوسطة التي تحتوي على HIP و 10٪ مصفوفة ولضوابط إضافة 10٪ مصفوفة المتوسطة دون HIP. استبدال المتوسطة كل يومين لمدة تصل إلى 10 أيام رصد تشكيل ماmosphere مع المجهر النقيض من المرحلة. لتحديد التمايز ، والماصات بعناية قبالة 10 ٪ مصفوفة HIP المتوسطة من الآبار وشطف طبقة 20 ٪ مصفوفة مع 350 ميكرولترات من الجليد البارد PBS.
ثم إضافة 70 إلى 100 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني مع EDTA ملليمتر واحد مباشرة في الآبار وفصل بلطف الطبقة السفلية من 100٪ مصفوفة مع طرف ماصة. هز لوحة بلطف في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. نقل بعناية تعليق كروية إلى أنبوب مخروطي وشطف الآبار مع 500 ميكرولتردات من برنامج تلفزيوني EDTA لاسترداد أي كروية المتبقية.
صخرة الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة إضافية للتأكد من أن المصفوفة يذوب تماما. إذا شوهدت كتل مصفوفة مرئية، أضف المزيد من PBS EDTA أو اهتز لفترة أطول. الطرد المركزي الحل في 350 مرات ز إلى بيليه spheroids.
ثم pirate المافق ، وليز الإسفنج ، والتحقيق في الخلايا لبيتا القضي ، cyclin D1 ، وp120RasGAP من قبل النشاف الغربية. هناك اعتماد صارخ على التمايز على قوة إشارة راك في خلايا HC11. في حين أن CRAC1 الذاتية مطلوبة للتمايز والمستويات المنخفضة من RacV12 تنشيط طفرة تسبب زيادة في قدرة التمايز، وارتفاع مستويات RacV12 تؤدي كتلة من التمايز والحث على الأورام.
عندما تم استكشاف خصائص التمايز من الخلايا EpH4 في ثقافة مصفوفة 3D، وجد أن إنتاج بيتا القضييين بلغت ذروتها في ثمانية إلى 10 أيام وكان التعبير D1 cyclin القصوى في أربعة إلى ستة أيام بعد التحفيز HIP. لتحديد موضع الخلايا الفردية ، كانت ملطخة DAPI وصورت مع المجهر confocal. ولوحظ موت الخلية الداخلية وتشكيل تجويفات جوفاء في الممومور بينما أدى إضافة HGF إلى تكوين هياكل أنبوبية.
يجب أن تضع في اعتبارك أن طلاء خلايا HC11 مهم. أيضا استخراج السليم من الخلايا EpH4 من المصفوفة أمر بالغ الأهمية لكمية البروتين لأن أي بقايا سوف تؤثر على تحديد البروتين. يمكن استخدام هذه التقنية للتحقق من محولات الإشارة الأخرى التي قد تتصرف بطريقة مماثلة.
إذا كان هناك طفرات السائق في السرطان، ثم تثبيط كامل لن يكون ضروريا لأن المستويات المنخفضة المتبقية من شأنه أن يؤدي في الواقع التمايز.
