تستخدم هذه الطريقة الطريقة المختلفة لمعالجة تحديات التعبير عن البروتين الفيروسي المؤتلف باستخدام بروتين فيروسي واحد P'كوصي لبروتين فيروسي آخر N'to الحصول على بروتينات N الخالية من الحمض النووي الريبي. يتم الحصول على البروتين N RSV خالية من الحمض النووي الريبي قبل تجميع الحمض النووي الريبي الفيروس محددة في nucleocapsid في المختبر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة مع غيرها من الفيروسات غير مجزأة الشعور السلبي RNA.
طريقة الاستنساخ الربط المستقل هو تقنية سريعة للحصول على بناء التعبير المشترك. لماذا أو الاختيارية وصمة عار المجهر الإلكتروني هو وسيلة سريعة لفحص تجميع كبيرة في الخلية الخام. نريد أن نقدم لك نصيحتين.
أولا، احصل على عائد مرتفع ونتائج قوية لكل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ثانيا، إعداد برامج مناسبة للكروماتوغرافيا وممارسة التقاط الشبكات مع ملقط. لبناء ثنائي cistronic من N و P التعبير المشترك, تنمو أربع ثقافات لتر واحد من خلايا سلالة E coli BL21DE3 في المتوسط LB في 37 درجة مئوية.
عندما تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.6، خفض درجة الحرارة إلى 16 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة، حث التعبير عن البروتين عن طريق العلاج مع 0.5 ملليمولار IPTG بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق الكريات في 200 ملليلتر من العازلة تحلل.
ازح الخلايا عن طريق سونيكيشن لمدة 15 دقيقة، مع ثلاث ثوان على، ثلاث ثوان قبالة البقول. وجمع الlysates عن طريق الطرد المركزي. تحميل supernatant في عمود جاذبية الكوبالت 2.5 في 10 سم، مع ما يقرب من 10 ملليلتر من الخرز.
تم إعادة توازنه مسبقا مع 5 إلى 10 وحدات تخزين عمود من المخزن المؤقت للتحلل. وغسل العمود مع خمسة أحجام العمود من المخزن المؤقت B وخمسة مجلدات من التخزين المؤقت C.Use مجلدين من D العازلة لe elute البروتين من الخرز. وتوازن العمود Q مع خمسة وحدات تخزين ملليلتر واحد من المخزن المؤقت QA.
استخدم مضخة تعلجية لتحميل العينة المخففة على العمود. قم بإذابة عمود Q المحمل على جهاز HPLC، إلى جانب مخازن QA وQB المؤقتة الطازجة. قم بتشغيل مغسلة المضخة لغسل الماكينة بنجاح باستخدام وحدة تخزين واحدة إلى وحدتي تخزين من مخازن QB و QA.
بعد الغسيل الأخير، حدد معدل التدفق إلى ملليلتر واحد في الدقيقة، وحدد الأشعة فوق البنفسجية 1 إلى 280 نانومتر والأشعة فوق البنفسجية 2 إلى 260 نانومتر، باستخدام لوحة بئر عميقة 96 لجمع الكسور. ثم استخدم تطبيق تدرج تدريجي من ثلاثة إلى أربعة أحجام من كل تركيز من عامل elution لe elute البروتينات، بدءا من تركيز 0٪ QB وزيادة النسبة المئوية بنسبة 5٪ في كل مرة. سوف يبروتين N-0 P مجمع في تركيز العازلة 15٪QB.
عزل البروتين عن طريق الترشيح هلام، في واحد من 30 سم عمود تنقية نطاق صغير، متوازن مع E.Then العازلة تحليل البروتين الذي يحتوي على كسور من قبل صفحة SDS. بالنسبة لتجميع النيوكليوكابسيد المحدد للفيروس، اخلط واحتضان مجمع N-0 P المنقى مع أوليغو الحمض النووي الريبي بنسبة جزيئية 1:1.5 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قبل equilibrate صغيرة النطاق تنقية هلام الترشيح العمود مع E.وإزالة أي هطول الأمطار عن طريق الطرد المركزي.
تحميل supernatant، إلى حجم استبعاد العمود الكروماتوغرافيا. وقارن حجم استبعاد الصور الكروماتوغرافيا للبروتين إلى التجمع الجيش الملكي النيبالي، والبروتين وحده السيطرة على العينات، والجمع بين نسب نقاء الحمض النووي، لتحديد القمم التي هي الحمض النووي الريبي N تجميعها، N-0 P والجيش الملكي النيبالي الحرة. لتجميع مجمع ن الجيش الملكي النيبالي، وجمع كل من ن RNA كسور الذروة، وإجراء استخراج الحمض النووي الريبي، وتشغيل هلام صفحة اليوريا للتحقق مرتين من طول الحمض النووي الريبي محددة.
لإعداد شبكة بقع سلبية للفحص المجهري الإلكتروني السلبي للبقع، استخدم لوحة حرارية لتسخين 5 مل من الماء المقطر المزدوج إلى الغليان وإضافة 37.5 ملليغرام منفورمات الأورانيل إلى الماء للحصول على محلول تلطيخ 0.75٪ من الأورانيل. نقل الحل إلى رقائق الألومنيوم المغطاة الكأس. وإضافة أربعة ميكرولترات من 10 هيدروكسيد الصوديوم المول.
بعد 15 دقيقة من التحريك المحمي من الضوء، قم بتصفية المحلول من خلال فلتر 0.22 ميكرون في أنبوب اختبار. لجعل شبكات المجهر الإلكتروني المغلفة بالكربون مستمرة هيدروفيلية، ضع الشبكات في غرفة متصلة بإمدادات الطاقة وتطبيق الأيونات المشحونة سلبا على الشبكات. قطع وأضعاف اثنين من قبل اثنين بوصة شريط بارا فيلم.
إضافة اثنين من 40 ميكرولتر قطرات من الماء المقطر إلى نهاية واحدة من الشريط. واثنين من 40 ميكرولتر قطرات من 0.75٪ محلول تلطيخ أورانيل formate إلى الطرف الآخر. إضافة ثلاثة ميكرولترات من عينة البروتين إلى كل شبكة.
بعد دقيقة واحدة، قم بحجب الشبكات ضد ورق النشاف واغمس الشبكات مرتين في قطرات الماء المقطر. ومرة واحدة في أول قطرة محلول تلطيخ. ثم تزج الشبكة في قطرات محلول تلطيخ الثاني لمدة 30 ثانية، قبل النشاف الشبكات ضد ورقة النشاف لإزالة أي حل وصمة عار الزائدة والسماح للشبكات لتجف الهواء قبل التصوير.
باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الحصول على فيروس ثنائي التزامن اللانمطي القابل للذوبان على نطاق واسع N0 P المعقدة. في الإشريكية القولونية E، يتم التعبير عن الطول الكامل لأجزاء N وN-terminal من بروتينات P مع 10 X علامتها على بروتين N. استنادا إلى نسبة نقاء حمض النيوكليك امتصاص الأشعة فوق البنفسجية، N0 P تحتوي على كل من طول كامل N و N-TERMINAL P، ولكن لا تحتوي على الحمض النووي الريبي الخلوية.
ويمكن بعد ذلك تحفيز N0 P المنقى وتجميعها في نواة مثل الجسيمات على شبكات المجهر الإلكتروني عن طريق الحضانة مع أوليغوس الحمض النووي الريبي محددة كما هو موضح. عند تنقية البروتين تجنب فقاعات الهواء أثناء تنقية العمود وتمييع العينة مع العازلة QA لضبط درجة الحموضة وتركيز الملح قبل تحميل العينة على العمود. الحرص على عقد شبكات المجهر الإلكتروني على الحافة الخارجية لتجنب تلويث الشبكات.
وهذا سوف يساعدنا على تحديد غير إيجابية RSV الجينوم التعبئة الأسئلة، سواء كان ذلك اليد اليسرى أو اليد اليمنى هيكل هلي. بعد تلك الإجراءات وأصيلة قالب الجيش الملكي النيبالي ل RSV بوليمراز نشاط المقايسة يمكن القيام به. ويمكن استخدام هذا RSV الفيروسية nucleocapsid محددة لتحليل عالية الدقة كريو EM.
