Этот метод использует различные способы решения проблем экспрессии рекомбинантного вирусного белка с использованием одного вирусного белка P'as шаперона для другого вирусного белка N', чтобы получить N-белки без РНК. Белок RSV N, не свободный от РНК, получают перед сборкой вирус-специфической РНК в нуклеокапсид in vitro. Метод также может быть использован с другими несегментарными вирусами отрицательной смысловой РНК.
Независимый метод лигирования является быстрым методом получения конструкций коэкспрессии. Почему или факультативы окрашивают электронный микроскоп является быстрым методом проверки крупной сборки в сырой клетке. Мы хотим дать вам два совета.
Во-первых, получите высокую урожайность и солидные результаты для каждого шага, прежде чем переходить к следующему шагу. Во-вторых, настройте правильные программы для хроматографии и попрактикуйтесь в подборе сеток щипцами. Для бицистронной конструкции коэкспрессии N и P вырастите четыре однолитровые культуры штаммовых клеток E coli BL21DE3 в среде LB при 37 градусах Цельсия.
Когда оптическая плотность на 600 нанометров достигнет 0,6, понизьте температуру до 16 градусов Цельсия. Через один час индуцируют экспрессию белка путем лечения 0,5 миллимолярным IPTG в течение ночи. На следующее утро соберите клетки путем центрифугирования и повторно суспендировать гранулы в 200 миллилитрах лизисного буфера.
лизей клеток ультразвуком в течение 15 минут, с тремя секундами вкл. и тремя секундами выключения импульсов. И соберите лизаты путем центрифугирования. Загрузите супернатант в гравитационный столб кобальта 2,5 на 10 сантиметров с примерно 10 миллилитрами бусин.
Предварительно уравновешивается от 5 до 10 столбцов объемов лизисного буфера. И промыть колонну с пятью колоннами объемов буфера B и пятью объемами буфера C. Используйте два объема буфера D для элюдировать белок из шариков. И уравновешивайте столбец Q пятью одном миллилитрными объемами буфера QA.
Используйте перистальтический насос для загрузки разбавленного образца на колонну. Расплавите загруженную колонну Q на машине HPLC вместе со свежими буферами QA и QB. Запустите мойку насоса, чтобы успешно вымыть машину с одним-двумя объемами буферов QB и QA.
После последней промывки установите скорость потока на один миллилитр в минуту и установите UV1 на 280 нанометров, а UV2 на 260 нанометров, используя пластину скважины глубиной 96 для сбора фракций. Затем используйте ступенчатое градиентное применение трех-четырех объемов каждой концентрации элюдионного агента для элюирования белков, начиная с концентрации 0% QB и увеличивая процент на 5% каждый раз. Белковый комплекс N-0 P элюирован при 15% буферной концентрации QB.
Выделяют белок путем гелевой фильтрации, в одну на 30 сантиметров мелкомасштабную очистительной колонну, уравновешенную буфером Е. Затем проанализируйте белок, содержащий фракции, по странице SDS. Для сборки специфического для вируса нуклеокапсида смешайте и инкубируем очищенный комплекс N-0 P с Олиго РНК в молекулярном соотношении 1:1,5 при комнатной температуре в течение одного часа. Предварительно уравновешивайте небольшую фильтрующую колонну гелевого очистителя с буфером E. И удалите любые осадки центрифугированием.
Загрузите супернатант, к размеру исключив хроматографическую колонку. И сравните размерные хроматографические изображения белка с сборкой РНК и только контрольные образцы белка, комбинируя соотношения чистоты нуклеиновых кислот, чтобы определить, какими пиками являются собранные N РНК, N-0 P и свободная РНК. Чтобы собрать комплекс N РНК, соберите все пиковые фракции N РНК, выполните экстракцию РНК и запустите гель с мочевиной, чтобы дважды проверить длину конкретной РНК.
Чтобы подготовить сетку отрицательных пятен для электронной микроскопии отрицательного пятна, используйте тепловую пластину для нагревания 5 мл двойной дистиллированной воды до кипения и добавьте 37,5 миллиграмма уранилформиата в воду для получения 0,75% раствора для окрашивания уранилформиата. Переложите раствор на покрытый алюминиевой фольгой мукер. И добавьте четыре микролитра 10 молярного гидроксида натрия.
После 15 минут перемешивания, защищенного от света, процедить раствор через фильтр 0,22 мкм в пробирку. Чтобы сделать сетки непрерывной электронной микроскопии с углеродным покрытием гидрофильными, поместите решетки в камеру, подключенную к источнику питания, и примените отрицательно заряженные ионы к сетям. Вырежьте и сложите полоску парапленки два на два дюйма.
Добавьте две 40 микролитровой капли дистиллированной воды на один конец полоски. И две 40 микролитровые капли 0,75% раствора для окрашивания уранилформата на другой конец. Добавьте три микролитра образца белка в каждую сетку.
Через минуту заблокируйте сетки от промокающей бумаги и дважды окуните сетки в дистиллированные капли воды. И один раз в первом окрашивающем растворе капельки. Затем погрузите сетку во вторую каплю окрашивающего раствора на 30 секунд, прежде чем смать сетки на промокатурной бумаге, чтобы удалить лишний раствор пятен и дать сеткам высохнуть на воздухе перед визуализацией.
С помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный респираторно-синцитиальный комплекс вируса N0 P. В E coli полная длина N и N-концевой частей P-белков совместно экспрессируется с 10 X Его меткой на N-белке. Основываясь на коэффициенте чистоты поглощения УФ-излучения нуклеиновых кислот, N0 P содержал как N полной длины, так и N-концевой P, но не содержал клеточной РНК.
Очищенный N0 P затем может быть стимулирован и собран в нуклеокапсидоподобные частицы на сетках электронной микроскопии путем инкубации со специфическими олигосами РНК, как показано на демонстрации. При очистке белка избегайте пузырьков воздуха во время очистки колонны и разбавьте образец буфером QA для регулировки pH и концентрации соли перед загрузкой образца на колонну. Позаботьтесь о том, чтобы держать сетки электронной микроскопии на внешнем краю, чтобы избежать заражения сеток.
Это поможет нам определить неположительный rsV-геном упаковочный вопрос, будь то левосторонняя или правосторонняя спиральная структура. Следуя этим процедурам и аутентичному шаблону РНК для анализа активности RSV-полимеразы, можно выполнить. И этот rsV вирусный специфический нуклеокапсид может быть использован для криоЭМ-анализа высокого разрешения.
