Este método utiliza as várias maneiras de enfrentar os desafios de expressão de proteína viral recombinante usando uma proteína viral P'as como acompanhante para outra proteína viral N'to obter proteínas N livres de RNA. A proteína RSV N livre de RNA é obtida antes de montar o RNA específico do vírus em nucleocapsídeo in vitro. O método também pode ser usado com outros vírus de RNA de sentido negativo não segmentado.
O método de clonagem independente de ligadura é uma técnica rápida para adquirir construções de co-expressão. Por que ou microscópio eletrônico de manchas eletivas é um método rápido para verificar grande montagem em células brutas. Queremos te dar duas dicas.
Primeiro, obtenha alto rendimento e resultados sólidos para cada passo antes de passar para o próximo passo. Em segundo lugar, configure programas adequados para cromatografia e prática de captação de grades com fórceps. Para a construção bi-cistrônica da co-expressão N e P, cresça quatro culturas de um litro de células de cepa E coli BL21DE3 em meio LB a 37 graus Celsius.
Quando a densidade óptica em 600 nanômetros atingir 0,6, reduza a temperatura para 16 graus Celsius. Após uma hora, induza a expressão proteica por tratamento com IPTG de 0,5 mililitro durante a noite. Na manhã seguinte, colete as células por centrifugação e resuspense as pelotas em 200 mililitros de tampão de lise.
Lise as células por sônica por 15 minutos, com três segundos ligados, três segundos fora dos pulsos. E recolher os lises por centrifugação. Carregue o supernaspe de 2,5 por 10 centímetros de coluna de gravidade de cobalto, com aproximadamente 10 mililitros de contas.
Pré-equilibrado com 5 a 10 volumes de coluna de tampão de lise. E lave a coluna com cinco volumes de coluna de tampão B e cinco volumes de buffer C.Use dois volumes de buffer D para elutar a proteína das contas. E equilibre a coluna Q com cinco volumes mililitros de buffer qa.
Use uma bomba peristáltica para carregar a amostra diluída na coluna. Derreta a coluna Q carregada na máquina HPLC, juntamente com buffers frescos de QA e QB. Execute a lavagem da bomba para lavar com sucesso a máquina com um a dois volumes de buffers de QB e QA.
Após a última lavagem, defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto, e defina UV1 a 280 nanômetros e UV2 a 260 nanômetros, usando uma placa de poço de 96 profundidades para coletar as frações. Em seguida, use uma aplicação gradiente passo a passo de três a quatro volumes de cada concentração de agente de elução para elutar as proteínas, começando em uma concentração de 0% DE QB e aumentando a porcentagem em 5% cada vez. O complexo proteico N-0 P será eluto na concentração de buffer de 15%.
Isole a proteína por filtragem de gel, em uma coluna de purificação de pequena escala por 30 centímetros, equilibrada com o buffer E.Em seguida, analise a proteína contendo frações pela página SDS. Para montagem nucleocáside específica do vírus, misture e incuba o complexo N-0 P purificado com oligo de RNA a uma razão molecular de 1:1,5 à temperatura ambiente por uma hora. Pré-equilibre uma coluna de filtragem de gel de purificação em pequena escala com e.buffer E.e remova qualquer precipitação por centrifugação.
Carregue o supernante, para a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho. E comparar as imagens de cromatografia de exclusão de tamanho da proteína com o conjunto de RNA, e amostras de controle somente de proteína, combinando as razões de pureza do ácido nucleico, para identificar quais são os picos montados N RNA, N-0 P e RNA livre. Para montar um complexo de RNA N, colete todas as frações de pico n RNA, realize uma extração de RNA e execute um gel de página de ureia para verificar novamente o comprimento do RNA específico.
Para preparar uma grade de manchas negativas para microscopia eletrônica de manchas negativas, use uma placa de calor para aquecer 5 mL de água dupla destilada à ebulição e adicionar 37,5 miligramas de formação uranyl à água para obter uma solução de coloração formada de 0,75% uranyl. Transfira a solução para um béquer coberto de papel alumínio. E adicione quatro microliters de 10 hidróxido de sódio molar.
Após 15 minutos de agitação protegido da luz, filtre a solução através de um filtro de 0,22 míccro em um tubo de ensaio. Para fazer as redes de microscopia eletrônica revestidas de carbono contínuas hidrofílicas, coloque as redes em uma câmara conectada a uma fonte de alimentação e aplique íons carregados negativamente nas redes. Corte e dobre uma tira de parafilme de duas por duas polegadas.
Adicione duas gotas de 40 microliter de água destilada em uma extremidade da tira. E duas quedas de 40 microliter de 0,75% de uranyl formam solução de coloração para a outra extremidade. Adicione três microliters de amostra de proteína a cada grade.
Após um minuto, bloqueie as grades contra papel manchador e mergulhe as grades duas vezes nas gotículas de água destiladas. E uma vez na primeira gota de solução de coloração. Em seguida, mergulhe a grade na segunda gota de solução de coloração por 30 segundos, antes de borrar as grades contra papel de mancha para remover qualquer solução de excesso de manchas e permitir que as grades sequem antes da imagem.
Usando este protocolo, um complexo sincicial respiratório hetero dimeric solúvel em larga escala N0 P complexo pode ser obtido. Em E coli, a extensão total das porções N e N-terminal das proteínas P são co-expressas com uma etiqueta 10 X His na proteína N. Com base na razão de pureza nucleática de ácido nucleônico de absorção UV, n0 P continha tanto o comprimento completo N quanto o N-terminal P, mas não continha RNA celular.
O N0 P purificado poderia então ser estimulado e montado em nucleocapsídeos como partículas em redes de microscopia eletrônica via incubação com oligos RNA específicos como demonstrado. Ao purificar a proteína evite bolhas de ar durante a purificação da coluna e dilua a amostra com tampão de QA para ajustar a concentração de pH e sal antes de carregar a amostra na coluna. Tome cuidado para manter as redes de microscopia eletrônica na borda externa para evitar contaminar as grades.
Isso nos ajudará a determinar as questões não positivas de embalagem do genoma RSV, se é estrutura helicoidal canhota ou destro. Seguindo esses procedimentos e autenticando um modelo de RNA para o ensaio de atividade de polimerase RSV pode ser realizado. E este nucleocapsídeo específico viral RSV pode ser usado para a análise crio EM de alta resolução.
