هذه الطريقة تجعل التصوير بالتبريد فائق الدقة ممكنا على الخلايا البيولوجية الكاملة لتحديد الهياكل الخلوية بدقة. ويمكن أيضا أن تستخدم جنبا إلى جنب مع غيرها من الطرائق كجزء من سير عمل التصوير المترابط. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن التصوير فائق الدقة يمكن القيام به بسرعة في ظروف التبريد باستخدام الفلوروفوريس التقليدية وجرعات الضوء المنخفض نسبيا.
CyroSIM هو أداة قوية توفر نظرة ثاقبة نحو فهم ديناميات البنية التحتية الخلوية استجابة للإشارات الداخلية أو الخارجية. ويشمل تطبيقه إنتاج اللقاحات ونشرها، ومراقبة الجودة، ومراقبة ما بعد السوق، وهندسة الأجسام المضادة وتحسينها، فضلا عن توصيف جزيئات النانو. مناورة عينات داخل مرحلة التبريد يأخذ الممارسة لضمان سلامة الشبكة.
من الأفضل أيضا التعرف على عناصر التحكم في نافذة Cockpit قبل جمع البيانات. للبدء، قم بإزالة الغطاء من ديوار الخارجي لمرحلة التبريد وصب النيتروجين السائل المصفا حتى يصبح ممتلئا بالربع تقريبا. انتظر حتى يهدأ الغليان الأولي قبل صب المزيد وملء السفينة إلى حوالي ثلثي كامل.
استبدال الغطاء بعناية، مشيرا فوهة بعيدا عن معالج كما يغلي النيتروجين السائل. بمجرد توقف النيتروجين السائل عن الخروج من المنفذ ، ضع أنبوب المنفذ على خشبة المسرح ديوار على مرحلة التبريد. قم بتوصيل مصدر الطاقة وتوصيل كابل USB وتوصيل ديوار الخارجي بالمرحلة.
بعد تسليم النيتروجين السائل، اضغط على زر الإفراج على مرحلة التبريد للسماح لها بدخول غرفة العينة والانتظار لمدة 30 إلى 45 دقيقة حتى يبرد النظام ويستقر قبل البدء في الحصول على الصورة. استخدم مفتاح سداسي ال اكس على أداة كاسيت لفتح لوحتين من كاسيت نقل العينة. فتح لوحات واسعة بما يكفي لإسقاط الشبكة بين لوحات اثنين، ولكن لا تفتح إلى أقصى موقف.
استخدام ملقط طويلة لرفع مربع الشبكة عينة من النيتروجين السائل. بدوره بحيث الشق محاذاة مع موقف التخزين داخل المرحلة ووضعه على خشبة المسرح. استخدم الجهاز المناسب لفتح غطاء صندوق التخزين إلى موضع العينة الصحيح.
باستخدام ملقط مقلوب، وإزالة الشبكة TEM من حامل العينة، تزج داخل النيتروجين السائل ضمان أن يتم وضع الجانب فيلم الكربون بحيث أنها سوف تواجه في نهاية المطاف الهدف على جسر العينة وإسقاطه في موقف في شريط نقل العينة. أغلق خرطوشة العينة باستخدام مفتاح سداسي الهيكس الموجود على أداة الكاسيت. استخدم نقطة المغناطيس الموجودة على أداة الكاسيت لرفع الخرطوشة التي تحتوي على الشبكة وتركيبها على جسر العينة.
يبقيه مغمورة أو قريبة من النيتروجين السائل وفي الاتجاه السليم. ضع شريط كاسيت مسطحا داخل دبابيس تحديد موضع الجسر وادفعه برفق لضمان إصلاحه. أغلق صندوق التخزين وأزله مع أي عينات متبقية.
حرك فتحة غطاء مرحلة التبريد إلى موضع التصوير وأطفئ ضوء غرفة العينة. حرك المرحلة نحو البصريات لمحاذاتها تحت العدسة الموضوعية ، ثم أسقط الهدف برفق في موضعه باستخدام الرافعة ، مع ضمان أن تقع داخل غطاء مرحلة التبريد ، ولكنها لا تلمسها. تغطية المرحلة والبصريات مع ستارة سوداء مبهمة، ثم بدء تشغيل برنامج التحكم قمرة القيادة على جهاز الكمبيوتر cryoSIM. انقر على زر وضع القراءة لكل كاميرا وتعيينه إلى CONV3 ميغاهيرتز.
تأكد من أن درجة حرارة كل كاميرا هي 80 درجة مئوية وأن مروحة الكاميرا خارج. بدوره على الكاميرا المنعكسة، تحت الضوء، واختيار المحيطة وتحت linkam، والتحقق من المكثف، ثم انقر على زر وضع الفيديو. في إطار عرض الفسيفساء، قم بالتصغير لرؤية مخطط الشبكة.
انقر على البحث عن المرحلة إذا كان لا يمكن أن ينظر إليها ووسط الشبكة عن طريق النقر المزدوج الأيسر في منتصف الدائرة. استخدم المفاتيح لأعلى ولأعلى لتركيز العينة حتى يتم التركيز على فيلم دعم الشبكة أو أي ميزة أخرى ذات صلة. استخدم المفاتيح التسعة والثلاثة الموجودة على اللوحة الرقمية لتغيير الخطوة Z.
بمجرد أن يتم توسيط المرحلة، قم بإيقاف تشغيل وضع الفيديو. جمع فسيفساء الضوء المرئي من خلال النقر على تشغيل الفسيفساء في عرض الفسيفساء لإنتاج البلاط من الصور الضوئية المرئية التي دوامة إلى الخارج من المركز. حفظ طريقة العرض عن طريق النقر على حفظ الفسيفساء.
تفقد فسيفساء Bright-field إلى جانب أي صور خريطة مضان سابقة عن طريق إيقاف تشغيل الضوء المحيط والمكثف وكذلك وضع الفيديو ، ثم قم بتشغيل ليزر الإثارة المطلوب واختر الكاميرا والتصفية المقابلة ، في البداية بسرعة 50 ملليواط لمدة 50 مللي ثانية. اضغط على صفر لالتقاط صورة ونجمة على تباين تلقائي. بدلا من ذلك، قم بضبط التباين يدويا باستخدام شريط التمرير في أسفل الصورة.
مرة واحدة تم العثور على خلايا مثيرة للاهتمام بيولوجيا مع مضان مناسبة، ووضع علامة على مواقعها باستخدام زر موقع علامة في عرض الفسيفساء. استمر في وضع علامة على جميع المواقع المحتملة قبل بدء اكتساب الصورة. إعادة حفظ الفسيفساء مع المواقع التي تم وضع علامة عليها عن طريق النقر على حفظ المواقع لملف.
لغرز صورة الفسيفساء باستخدام برنامج stitchEm، اسحب وأسقط ملف الفسيفساء النصي في ملف stitchEm مع BAT التمديد وحفظ صورة TIF المدمجة من البلاط الفسيفساء في نفس المجلد. لحفظ صورة مع المواقع التي تم وضع علامة عليها، اسحب ملف الفسيفساء النصي وملف العلامات النصي وأسقطه في الرمز في نفس الوقت. تعيين وقت التعرض بالليزر استنادا إلى التهم والنطاق الديناميكي في صورة مضان في الجزء السفلي من إطار عرض الكاميرا.
اختر أي مرشح لتطبيق وتحسين إعدادات كل طول موجي من ضوء الإثارة لاستخدامها، وتحول كل ليزر على حدة. انقر على كل من الكاميرات لتشغيلها. العودة إلى أحد المواقع ملحوظ والتركيز على العمق المطلوب مرة أخرى.
مرة واحدة في التركيز في مجال الاهتمام، انتقل من التركيز باستخدام مفتاح السهم لأعلى في إطار XY على مرحلة الماكرو لاختيار ارتفاع المكدس Z للحصول على وانقر على حفظ أعلى. الخروج من التركيز باستخدام مفتاح السهم لأسفل، انقر على حفظ أسفل، ثم على الذهاب إلى المركز، والتحقق من أن الصورة لا تزال في التركيز. في إطار Cockpit حدد تجربة الموقع الواحد.
من القائمة المنسدلة حدد إضاءة منظمة. تغيير ارتفاع المكدس بحيث يساوي ارتفاع Z بالإضافة إلى متر واحد صغير. أدخل أوقات التعرض بالمللي ثانية لأجهزة الليزر 405 و488 نانومتر في الصف العلوي للكاميرا المنعكسة وأوقات التعرض لأشعة الليزر 561 و647 نانومتر في الصف السفلي للكاميرا المرسلة.
إدخال اسم ملف وانقر على التحديث لإنتاج ملف جديد يحتوي على التاريخ والوقت دون تجاوز الملفات السابقة، ثم انقر على ابدأ. إذا كان النيتروجين السائل ديوار يعيد تعبئة مرحلة التبريد أثناء الحصول على الصورة، قم بإجهاض العملية عن طريق النقر على زر ABORT في برنامج Cockpit. في كل موقف، وجمع Z-كومة باستخدام الضوء المرئي عن طريق إيقاف أشعة الليزر والتبديل على الضوء المحيط والمكثف.
ضمن تجربة الموقع الواحد، حدد Z-stack وحدد الضوء المحيط إلى 20 مللي ثانية من التعرض، مع الحفاظ على ارتفاع Z. كرر هذه العملية لكافة المواقع التي تم وضع علامة عليها. بعد الانتهاء من التصوير إلغاء إرساء المرحلة وإزالة جميع العينات.
إيقاف ضوء غرفة العينة. افصل ديوار الخارجي وتخلص من أي نيتروجين سائل متبقي في حاوية أخرى متوافقة مع التبريد، مما يسمح للديوار بالعودة بأمان إلى درجة حرارة طبيعية. انتظر حتى يصبح خيار خبز عرض مرحلة التبريد متاحا بعد عدم بقاء النيتروجين السائل في مرحلة Dewar.
اضغط على زر الخبز للدخول في وضع التدفئة. وضع غطاء المكونات على مرحلة التبريد. القرار في cryoSIM أعلى بكثير من ذلك في المجهر epifluorescence القياسية.
يمكن استخدام خريطة الفلورسينس من مجهر الفلوروريسينسي التقليدي لتحديد المناطق ذات الأهمية للتصوير ويمكن الحصول على صورة cryoSIM المقابلة من موقع على الشبكة. كانت عينة تحتوي على خلايا U2OS ملطخة بمزيج من صبغ الهيكل الخلوي microtubule الأخضر وصبغة الميتوكوندريا الحمراء مما أدى إلى تلطيخ مكون microtubule من الهيكل الخلوي والميتوكوندريا. أظهر التصوير اللاحق توطين الميتوكوندريا داخل الخلية ، وكذلك ترتيب الخلايا الدقيقة ، مما يسلط الضوء على الإطار الهيكلي الذي توفره للخلية وتجميع الهيكل الخلوي حول العضيات.
يمكن لعملية إعادة بناء SIM إنتاج القطع الأثرية التي يمكن تحديدها باستخدام SIMCheck ، وهو مكون إضافي مجاني imageJ. تظهر خريطة تباين التشكيل هذه التي تم إنشاؤها باستخدام SIMCheck مناطق تباين التشكيل المنخفض داخل منطقة النواة ، مما يشير إلى أن هذه المنطقة ستكون أكثر عرضة لقطع إعادة الإعمار. يشير السهم الأبيض إلى قطعة أثرية لإعادة البناء.
عند محاولة هذا البروتوكول تأكد من أن العينة لا تزال مغمورة أو قريبة من النيتروجين السائل في جميع الأوقات لتجنب إزالة التزجيج. كما انتبه إلى أوقات التعرض والتعول في النطاق الديناميكي ، لأن هذا يؤثر على جودة البيانات ويتجنب تلف الليزر للعينة. بعد التصوير بالتبريد، يمكن تصوير نفس العينات مع طرائق أخرى مثل التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة، والتي لدينا هنا في B24 Beamline.
من خلال الجمع بين صور cryoSIM والصور التي تحتوي على معلومات هيكلية حول الخلية ، يمكننا الإجابة على الأسئلة الإضافية الرئيسية حول البنية الفوقية الخلوية والوظيفة.
