Cette méthode rend possible l’imagerie cryogénique à super résolution sur des cellules biologiques entières pour identifier avec précision les structures cellulaires. Il peut également être utilisé conjointement avec d’autres modalités dans le cadre d’un flux de travail d’imagerie corrélative. Les principaux avantages de cette technique sont que l’imagerie à super résolution peut être réalisée rapidement dans des conditions cryogéniques en utilisant des fluorophores conventionnels et des doses de lumière relativement faibles.
CyroSIM est un outil puissant qui fournit des informations pour comprendre la dynamique de l’ultrastructure cellulaire en réponse à des signaux internes ou externes. Ses applications comprennent la production et le déploiement de vaccins, le contrôle de la qualité, la surveillance post-commercialisation, l’ingénierie et l’optimisation des anticorps, ainsi que la caractérisation des nanoparticules. Manœuvrer des échantillons dans la cryo-étape nécessite de la pratique pour assurer la sécurité du réseau.
Il est également préférable de vous familiariser avec les commandes de la fenêtre Cockpit avant la collecte des données. Pour commencer, retirez le couvercle du Dewar externe de l’étage cryogénique et versez de l’azote liquide filtré jusqu’à ce qu’il soit rempli d’environ un quart. Attendez que l’ébullition initiale disparaisse avant d’en verser plus et remplissez le récipient à environ deux tiers plein.
Remplacez soigneusement le couvercle en pointant la buse loin du manipulateur lorsque l’azote liquide bout. Une fois que l’azote liquide a cessé de sortir de la sortie, placez le tuyau de sortie au-dessus de l’étage Dewar sur l’étage cryogénique. Branchez la source d’alimentation, connectez le câble USB et branchez le Dewar externe à la scène.
Après la livraison de l’azote liquide, appuyez sur le bouton de déverrouillage de l’étage cryogénique pour lui permettre d’entrer dans la chambre d’échantillonnage et attendez 30 à 45 minutes que le système refroidisse et se stabilise avant de commencer l’acquisition d’images. Utilisez la touche hexadétienne de l’outil cassette pour ouvrir les deux plaques de la cassette de transfert d’échantillons. Ouvrez les plaques assez largement pour laisser tomber la grille entre les deux plaques, mais ne les ouvrez pas à la position maximale.
Utilisez de longues pinces pour soulever la boîte de grille d’échantillonnage de l’azote liquide. Tournez-le de sorte que l’encoche s’aligne sur la position de stockage à l’intérieur de la scène et placez-la sur la scène. Utilisez l’appareil approprié pour ouvrir le couvercle de la boîte de rangement à la bonne position de l’échantillon.
À l’aide de pinces inversées, retirez la grille TEM du porte-échantillon, immergez-la à l’intérieur de l’azote liquide en vous assurant que le côté du film de carbone est placé de manière à ce qu’il soit finalement orienté vers l’objectif sur le pont d’échantillon et déposez-le en position dans la cassette de transfert d’échantillon. Fermez la cartouche d’échantillon à l’aide de la touche hexadétiste de l’outil cassette. Utilisez le point magnétique de l’outil de cassette pour soulever et monter la cartouche contenant la grille sur le pont d’échantillonnage.
Gardez-le immergé ou près de l’azote liquide et dans la bonne orientation. Placez la cassette à plat dans les broches de positionnement du pont et poussez-la doucement pour vous assurer qu’elle est fixée. Fermez et retirez la boîte de stockage ainsi que les échantillons restants.
Déplacez l’ouverture du couvercle de l’étage cryogénique vers la position d’imagerie et éteignez la lumière de la chambre d’échantillonnage. Faites glisser la scène vers l’optique pour l’aligner sous la lentille de l’objectif, puis laissez doucement tomber l’objectif en position à l’aide du levier, en vous assurant qu’il repose dans le couvercle du cryo-étage, mais ne le touche pas. Couvrez la scène et l’optique avec un rideau noir opaque, puis démarrez le logiciel de contrôle Cockpit sur le PC cryoSIM. Cliquez sur le bouton du mode de lecture pour chaque caméra et réglez-le sur CONV3 mégahertz.
Vérifiez que la température de chaque caméra est de 80 degrés Celsius et que le ventilateur de la caméra est éteint. Allumez la caméra réfléchie, sous la lumière, choisissez ambiant et sous linkam, vérifiez le condenseur, puis cliquez sur le bouton du mode vidéo. Dans la fenêtre mosaïque, effectuez un zoom arrière pour afficher le contour de la grille.
Cliquez sur Trouver une scène si elle ne peut pas être vue et centrez la grille en double-cliquant à gauche au milieu du cercle. Utilisez les touches haut et bas pour focalisation de l’échantillon jusqu’à ce que le film de support de grille ou toute autre fonction pertinente soit mis au point. Utilisez les neuf et trois touches du pavé numérique pour modifier l’étape Z.
Une fois la scène centrée, désactivez le mode vidéo. Collectez une mosaïque de lumière visible en cliquant sur Exécuter la mosaïque dans la vue mosaïque pour produire des tuiles d’images de lumière visible qui tournent en spirale vers l’extérieur à partir du centre. Enregistrez la vue en cliquant sur Enregistrer la mosaïque.
Inspectez la mosaïque de champ lumineux à côté de toutes les images cartographiques de fluorescence précédentes en éteignant la lumière ambiante et le condenseur ainsi que le mode vidéo, puis allumez le laser d’excitation requis et choisissez la caméra et le filtre correspondants, initialement à 50 milliwatts pour un temps d’exposition de 50 millisecondes. Appuyez sur zéro pour accrocher une image et étoile pour contraster automatiquement. Vous pouvez également ajuster manuellement le contraste à l’aide du curseur en bas de l’image.
Une fois que des cellules biologiquement intéressantes avec une fluorescence appropriée ont été trouvées, marquez leurs positions à l’aide du bouton marquer le site dans la vue Mosaïque. Continuez à marquer tous les sites potentiels avant de commencer l’acquisition d’images. Enregistrez à nouveau la mosaïque avec les sites marqués en cliquant sur Enregistrer les sites dans le fichier.
Pour assembler l’image de mosaïque à l’aide du logiciel stitchEm, faites glisser et déposez le fichier de mosaïque de texte dans le fichier stitchEm avec l’extension BAT et enregistrez l’image TIF combinée des mosaïques dans le même dossier. Pour enregistrer une image avec les sites marqués, faites glisser et déposez le fichier texte mosaïque et le fichier texte des marqueurs dans l’icône en même temps. Réglez le temps d’exposition laser en fonction des nombres et de la plage dynamique dans l’image de fluorescence au bas de la fenêtre de vue de la caméra.
Choisissez le filtre à appliquer et optimisez les paramètres pour chaque longueur d’onde de lumière d’excitation à utiliser, en allumant chaque laser séparément. Cliquez sur les deux caméras pour les allumer. Revenez à l’un des sites marqués et concentrez-vous à nouveau sur la profondeur souhaitée.
Une fois au point dans une zone d’intérêt, déplacez-vous hors de la mise au point à l’aide de la touche fléchée vers le haut dans la fenêtre XY de la scène macro pour choisir la hauteur de la pile Z à acquérir et cliquez sur Enregistrer en haut. Déplacez-vous hors de la mise au point à l’aide de la touche fléchée vers le bas, cliquez sur Enregistrer en bas, puis sur Aller au centre, vérifiez que l’image est toujours au point. Dans la fenêtre Cockpit, sélectionnez Expérience sur un seul site.
Dans la liste déroulante, sélectionnez Éclairage structuré. Modifiez la hauteur de la pile pour qu’elle soit égale à la hauteur Z plus un micromètre. Entrez les temps d’exposition en millisecondes pour les lasers de 405 et 488 nanomètres dans la rangée supérieure pour la caméra réfléchie et les temps d’exposition pour les lasers de 561 et 647 nanomètres dans la rangée inférieure pour la caméra transmise.
Entrez un nom de fichier et cliquez sur mettre à jour pour produire un nouveau fichier contenant la date et l’heure sans remplacer les fichiers précédents, puis cliquez sur Démarrer. Si l’azote liquide Dewar remplit l’étage cryogénique lors de l’acquisition de l’image, abandonnez le processus en cliquant sur le bouton ABORT du logiciel Cockpit. À chaque position, collectez une pile Z à l’aide de la lumière visible en éteignant les lasers et en allumant la lumière ambiante et le condenseur.
Sous Expérience sur un seul site, sélectionnez Z-stack et réglez la lumière ambiante sur une exposition de 20 millisecondes, en maintenant la hauteur Z. Répétez ce processus pour tous les sites marqués. Une fois l’imagerie terminée, désamarrer la scène et retirer tous les échantillons.
Éteignez le voyant de la chambre d’échantillonnage. Débranchez le Dewar externe et décantez tout l’azote liquide restant dans un autre récipient cryocompatible, ce qui permet au Dewar de revenir en toute sécurité à une température normale. Attendez que l’option de cuisson de l’écran cryo-étage soit disponible après qu’il ne reste plus d’azote liquide dans la scène Dewar.
Appuyez sur le bouton de cuisson pour passer en mode chauffage. Placez le bouchon du couvercle sur la cryo-scène. La résolution dans cryoSIM est significativement plus élevée que celle de la microscopie à épifluorescence standard.
La carte de fluorescence d’un microscope à épifluorescence conventionnel peut être utilisée pour localiser des zones d’intérêt pour l’imagerie et l’image cryoSIM correspondante peut être obtenue à partir d’un emplacement sur la grille. Un échantillon contenant des cellules U2OS a été coloré avec un mélange de colorant de cytosquelette de microtubules verts et de colorant de mitochondries rouges, ce qui a entraîné la coloration du composant microtubule du cytosquelette et des mitochondries. Des images ultérieures ont montré la localisation des mitochondries dans la cellule, ainsi que la disposition des microtubules, mettant en évidence le cadre structurel qu’ils fournissent à la cellule et l’assemblage du cytosquelette autour des organites.
Le processus de reconstruction SIM peut produire des artefacts qui peuvent être identifiés à l’aide de SIMCheck, un plugin imageJ gratuit. Cette carte de contraste de modulation générée à l’aide de SIMCheck montre les zones de faible contraste de modulation dans la zone du noyau, indiquant que cette région sera plus sensible aux artefacts de reconstruction. La flèche blanche indique un artefact de reconstruction.
Lorsque vous tentez ce protocole, assurez-vous que l’échantillon reste immergé ou proche de l’azote liquide en tout temps pour éviter la dévitrification. Faites également attention aux temps d’exposition et aux comptes dans la plage dynamique, car cela affecte la qualité des données et évite les dommages laser à l’échantillon. Après l’imagerie cryogénique, les mêmes échantillons peuvent être imagés avec d’autres modalités telles que la tomographie aux rayons X cryo-doux, que nous avons ici à la ligne de faisceau B24.
En combinant des images cryoSIM avec des images contenant des informations structurelles sur la cellule, nous pouvons répondre à des questions supplémentaires clés sur l’ultrastructure et la fonction cellulaires.
