Este método torna possível a super resolução de imagens criográficas em células biológicas inteiras para identificar com precisão estruturas celulares. Também pode ser usado em conjunto com outras modalidades como parte de um fluxo de trabalho de imagem correlativo. As principais vantagens desta técnica são que a imagem de super resolução pode ser feita rapidamente em condições criogênicas usando fluoroforos convencionais e doses de luz relativamente baixas.
O CyroSIM é uma ferramenta poderosa que fornece insights para entender a dinâmica da ultraestrutura celular em resposta a pistas internas ou externas. Sua aplicação inclui produção e implantação de vacinas, controle de qualidade, vigilância pós-mercado, engenharia e otimização de anticorpos, bem como caracterização de nanopartículas. Amostras de manobra dentro da crio-etapa praticam para garantir a segurança da grade.
Também é melhor se familiarizar com os controles na janela do Cockpit antes da coleta de dados. Para começar, remova a tampa do Dewar externo do crio-estágio e despeje nitrogênio líquido filtrado até que esteja aproximadamente um quarto cheio. Aguarde até que a ebulição inicial diminua antes de derramar mais e encha a embarcação para cerca de dois terços cheios.
Substitua a tampa cuidadosamente, apontando o bocal para longe do manipulador enquanto o nitrogênio líquido ferve. Uma vez que o nitrogênio líquido parou de sair da tomada, coloque o tubo de saída sobre o palco Dewar no crio-palco. Conecte a fonte de alimentação, conecte o cabo USB e conecte o Dewar externo ao estágio.
Após a entrega de nitrogênio líquido, pressione o botão de liberação no crio-palco para permitir que ele entre na câmara de amostra e espere de 30 a 45 minutos para que o sistema esfrie e estabilize antes de começar com a aquisição da imagem. Use a chave hexa, na ferramenta para abrir as duas placas do de transferência de amostra. Abra as placas largas o suficiente para soltar a grade entre as duas placas, mas não abra para a posição máxima.
Use fórceps longos para levantar a caixa da grade de amostra para fora do nitrogênio líquido. Gire-o para que o entalhe se alinhe com a posição de armazenamento dentro do palco e coloque-o no palco. Use o dispositivo apropriado para abrir a tampa da caixa de armazenamento na posição correta da amostra.
Usando fórceps invertidos, remova a grade TEM do suporte da amostra, mergulhe-a dentro do nitrogênio líquido garantindo que o lado da película de carbono seja colocado de modo que ele esteja, em última análise, voltado para o objetivo na ponte amostral e solte-o em posição no de transferência de amostra. Feche o cartucho de amostra usando a tecla hexax na ferramenta. Use o ponto de ímã na ferramenta de para levantar e montar o cartucho contendo a grade na ponte de amostra.
Mantenha-o imerso ou próximo do nitrogênio líquido e na orientação adequada. Coloque o dentro dos pinos de posicionamento da ponte e cutuque-o suavemente para garantir que ele esteja fixo. Feche e remova a caixa de armazenamento junto com todas as amostras restantes.
Mova a tampa do estágio crioco para a posição de imagem e desligue a luz da câmara de amostra. Deslize o palco em direção à óptica para alinhá-lo sob a lente objetiva, em seguida, solte suavemente o objetivo em posição usando a alavanca, garantindo que ele repouse dentro da tampa do crio-estágio, mas não toque nele. Cubra o palco e a óptica com uma cortina preta opaca, em seguida, inicie o software de controle Cockpit no PC crioSIM. Clique no botão de modo de leitura de cada câmera e ajuste-o para o mega-hertz CONV3.
Verifique se a temperatura de cada câmera é de 80 graus Celsius e que o ventilador da câmera está desligado. Ligue a câmera refletida, sob luz, escolha ambiente e em linkam, verifique o condensador e clique no botão do modo de vídeo. Na janela de visualização do Mosaico, amplie para ver o contorno da grade.
Clique em Encontrar o Palco se não puder ser visto e centralizar a grade clicando duas vezes no meio do círculo. Use as teclas para cima e para baixo para concentrar a amostra até que o filme de suporte à grade ou qualquer outro recurso relevante esteja em foco. Use as nove e três teclas na almofada numérica para alterar o passo Z.
Uma vez que o palco esteja centrado, desligue o modo de vídeo. Colete um mosaico de luz visível clicando em Run Mosaic na vista do mosaico para produzir telhas de imagens de luz visível que espiral para fora do centro. Salve a exibição clicando em Salvar mosaico.
Inspecione o mosaico de campo brilhante ao lado de qualquer imagem anterior do mapa da fluorescência desligando a luz ambiente e o condensador, bem como o modo de vídeo, em seguida, ligue o laser de excitação necessário e escolha a câmera e filtro correspondentes, inicialmente a 50 miliwatts para um tempo de exposição de 50 milissegundos. Pressione zero para encaixar uma imagem e estrelar para contraste automático. Alternativamente, ajuste manualmente o contraste usando o controle deslizante na parte inferior da imagem.
Uma vez que células biologicamente interessantes com fluorescência adequada foram encontradas, marque suas posições usando o botão do local de marca na vista do Mosaico. Continue marcando todos os sites potenciais antes de iniciar a aquisição de imagens. Salve o mosaico com os sites marcados clicando em sites salvar para arquivar.
Para costurar a imagem do mosaico usando o software stitchEm, arraste e solte o arquivo mosaico de texto no arquivo stitchEm com o BAT de extensão e salve a imagem TIF combinada das telhas de mosaico na mesma pasta. Para salvar uma imagem com os sites marcados, arraste e solte o arquivo de texto do mosaico e o arquivo de texto dos marcadores no ícone ao mesmo tempo. Defina o tempo de exposição a laser com base nas contagens e no alcance dinâmico da imagem de fluorescência na parte inferior da janela de visualização da câmera.
Escolha qual filtro aplicar e otimizar as configurações para cada comprimento de onda de luz de excitação a ser usada, ligando cada laser separadamente. Clique em ambas as câmeras para ligá-las. Retorne a um dos locais marcados e foque na profundidade desejada novamente.
Uma vez em foco em uma área de interesse, saia do foco usando a tecla de seta para cima na janela XY no palco macro para escolher a altura da pilha Z para adquirir e clicar em Salvar a parte superior. Saia do foco usando a tecla seta para baixo, clique em Salvar a parte inferior e, em seguida, vá para o centro, verifique se a imagem ainda está em foco. Na janela Cockpit selecione o experimento single-site.
Na lista de drop-down selecione Iluminação Estruturada. Altere a altura da pilha de modo que seja igual à altura Z mais um micrometro. Digite os tempos de exposição em milissegundos para os lasers de 405 e 488 nanômetros na linha superior para a câmera refletida e os tempos de exposição para os lasers de 561 e 647 nanômetros na linha inferior para a câmera transmitida.
Insira um nome de arquivo e clique em atualizar para produzir um novo arquivo contendo a data e a hora sem substituir os arquivos anteriores e clique em Iniciar. Se o nitrogênio líquido Dewar reabastecer o estágio criográfico durante a aquisição de imagem, aborte o processo clicando no botão ABORT no software Cockpit. Em cada posição, colete uma pilha Z usando luz visível desligando os lasers e ligando a luz ambiente e o condensador.
Em experimento de um único local, selecione z-stack e ajuste a luz ambiente para exposição de 20 milissegundos, mantendo a altura Z. Repita este processo para todos os locais marcados. Após a imagem ser concluída, desencaixe o estágio e remova todas as amostras.
Desligue a luz da câmara de amostra. Desligue o Dewar externo e decante qualquer nitrogênio líquido restante em outro recipiente compatível com crio, permitindo que o Dewar retorne com segurança a uma temperatura normal. Aguarde até que a opção de assar o display crio-palco fique disponível depois que não permanecer mais nitrogênio líquido no estágio Dewar.
Pressione o botão bake out para entrar no modo de aquecimento. Coloque a tampa no palco criogeno. A resolução no crioSIM é significativamente maior do que a da microscopia de epifluorescência padrão.
O mapa de fluorescência de um microscópio convencional de epifluorescência pode ser usado para localizar áreas de interesse para imagens e a imagem crioSIM correspondente pode ser obtida a partir de um local na grade. Uma amostra contendo células U2OS foi manchada com uma mistura de corante de citoesqueleto de microtúbulo verde e corante de mitocôndrias vermelhas resultando na coloração do componente microtúbulo do citoesqueleto e das mitocôndrias. Imagens subsequentes mostraram a localização de mitocôndrias dentro da célula, bem como o arranjo dos microtúbulos, destacando a estrutura estrutural que fornecem à célula e a montagem do citoesqueleto em torno das organelas.
O processo de reconstrução do SIM pode produzir artefatos que podem ser identificados usando o SIMCheck, um plugin de imagem gratuitoJ. Este mapa de contraste de modulação gerado por meio do SIMCheck mostra áreas de baixo contraste de modulação dentro da área do núcleo, indicando que essa região será mais suscetível a artefatos de reconstrução. A seta branca indica um artefato de reconstrução.
Ao tentar este protocolo certifique-se de que a amostra permanece submersa ou próxima de nitrogênio líquido o tempo todo para evitar a des vitrificação. Também preste atenção aos tempos de exposição e conta na faixa dinâmica, pois isso afeta a qualidade dos dados e evita danos a laser na amostra. Após a imagem criográfica, as mesmas amostras podem ser imagens com outras modalidades, como a tomografia de raios-X crio-macio, que temos aqui na Linha B24.
Combinando imagens crioSIM com imagens contendo informações estruturais sobre o celular, podemos responder a perguntas adicionais importantes sobre ultraestrutura celular e função.
