1. خطوات التحضير
<ol><li>إعداد مرق مولر-هينتون (MHB) بإضافة 25 غرام من مرق MH إلى 1 لتر من الماء المقطر والمزيج. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. ثم، تخزين الوسائط autoclaved في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة.</li>
	<li>زراعة البكتيريا الفرعية في السؤال(E. coli ESBL) على وسائل الإعلام أجار باستخدام طريقة streaking أربعة أرباع واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.<ol>
<li>باستخدام حلقة معقمة، واتخاذ مستعمرة واحدة ونشرها في النصف الأول من لوحة أغار ماكونكي عن طريق القيام الشرائط المتوازية وثيقة.</li>
		<li>باستخدام الحلقة، نشر البكتيريا في الربع الثاني عن طريق streaking من الربع الأول.</li>
		<li>من الربع الثاني، قم بتوسيع الشرائط في الربع الثالث باستخدام خطوط متوازية قريبة.</li>
		<li>نشر البكتيريا في وسط الربع الرابع عن طريق streaking من الربع الثالث.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد الفريق
<ol><li>ضع أربع لوحات من 96 بئرا بجانب بعضها البعض لتشكيل مربع. باستخدام شريط، الشريط أسفل معا.</li>
	<li>كرر هذه الخطوة للحصول على أربع لوحات تحتوي كل منها على 4 لوحات وتسميتها A1 و A2 و A3 و A4.</li>
	<li>أضف 50 ميكرولتر من مرق MH إلى الآبار بين العمود 2 والعمود 11 في لوحات 16 96-well من اللوحات الأربع.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر من مرق MH إلى بئر H12 بمثابة السيطرة السلبية بشكل جيد في لوحات 16 96 جيدا من الألواح الأربعة.</li>
	<li>إضافة 150 ميكروغرام من مرق MH إلى الآبار A1 و H1 بمثابة آبار التحكم الإيجابية في لوحات 16 96 جيدا من الألواح الأربعة.</li>
</ol>3. المخدرات 1، سيفوتيكسيم، تخفيف المسلسل
<ol><li>إلى أنبوب مخروطي، أضف 15 مل من dH2O المعقم.<ol>
<li>حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 15 مل) / C1. ملاحظة: في حالتنا، حل الأسهم Cefotaxime هو 105 ميكروغرام / مل وجيم2 هو 256 ميكروغرام / مل. وهكذا، V1 = 38.4 ميكرولتر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إزالة حجم محسوب من 15 مل من dH2O العقيمة، ومن ثم إضافة الدواء.</li>
	<li>ماصة 50 ميكرولتر من محلول الدواء المعد في كل بئر في العمود 11 والعمود 12 باستثناء H12.</li>
	<li>ابدأ التخفيف التسلسلي عن طريق إزالة 50 ميكرولتر من العمود 11 ووضعه في الآبار المقابلة في العمود 10 ، ثم من 10 حتى الوصول إلى العمود 2 حيث سيتم التخلص من 50 ميكرولتر المأخوذة من العمود 2.</li>
	<li>كرر الخطوتين 3.4 و3.5 لجميع لوحات الآبار 96 16 من الألواح الأربعة.</li>
</ol>4. المخدرات 2، Amkacin، المخفف المسلسل
<ol><li>إلى أنبوب مخروطي، أضف 10 مل من dH2O المعقم.</li>
	<li>حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 10 مل) / C1. ملاحظة: في حالتنا، حل مخزون أميكاسين هو 103 ميكروغرام/مل و C2 هو 64 ميكروغرام/مل. وهكذا، V1 = 64 ميكرولتر.</li>
	<li>إزالة حجم محسوب من 10 مل من DH2O العقيمة، ومن ثم إضافة الدواء.</li>
	<li>خذ ثماني لوحات منفصلة من 96 بئرا.</li>
	<li>إلى كل لوحة، أضف 100 ميكرولتر من MHB إلى الآبار بين الصفين G و B.</li>
	<li>إضافة 100 ميكرولتر من المخدرات التي أعدت سابقا 2 حل إلى آبار الصف G.</li>
	<li>تمييع تسلسليا من الصف G إلى الصف B عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من كل بئر وأخيرا تجاهل 100 ميكرولتر من آبار الصف B.</li>
	<li>كرر الخطوات 4.5 و4.6 و4.7 لإعداد ثمانية أطباق.</li>
</ol>5. نقل المخدرات 2 إلى أربعة لوحات
<ol><li>ماصة 50 ميكرولتر من المخدرات 2 من الآبار بين الصفين G و B في الآبار المقابلة في كل لوحة في الألواح الأربعة. لوحة واحدة أعدت 96 جيدا يحتوي على 100 ميكروغرام من المخدرات 2 التي تكفي لاثنين من لوحات في لوحة واحدة.</li>
</ol>6. المخدرات 3، ليفوفلوكساسين، بالإضافة إلى
<ol><li>إلى أربعة أنابيب مخروطية مختلفة، أضف 14 مل من dH2O العقيم.</li>
	<li>حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 14 مل) / C1. ملاحظة: في حالتنا، يتم إعداد ليفوفلوكساسين في أربعة تركيزات مختلفة من محلول المخزون من 5 × 103 ميكروغرام / مل. C1 = 2 ميكروغرام/مل، V1 = 5.6 ميكرولتر C2 = 4 ميكروغرام/مل، V1 = 11.2 ميكرولتر C3 = 8 ميكروغرام/مل، V1 = 22.4 ميكرولتر C4 = 16 ميكروغرام/مل، V1 = 44.8 ميكرولتر</li>
	<li>إزالة حجم محسوب من 14 مل من DH2O العقيمة من كل أنبوب، ومن ثم إضافة الدواء.</li>
	<li>بعد إعداد التركيزات المطلوبة من الدواء الثالث ، خذ 50 ميكرولتر وأضفها إلى الآبار المقابلة بين الصفين B و G والأعمدة 2 و 12 في اللوحة المقابلة في كل لوحة حيث يتوافق C1 مع لوحات P1 الأربعة في الألواح الأربعة ، يتوافق C2 مع لوحات P2 الأربعة في الألواح الأربعة ، C3 يتوافق مع لوحات P3 الأربعة في الألواح الأربعة، وC4 يتوافق مع لوحات P4 الأربعة في الألواح الأربعة.</li>
</ol>7. المخدرات 4، تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول، إضافة إلى ذلك
<ol><li>إلى أنبوب مخروطي، أضف 14 مل من dH2O المعقم.</li>
	<li>حساب حجم أن تتم إزالتها من محلول المخزون من المخدرات بعد الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 14 مل) / C1. ملاحظة: في حالتنا، يتم إعداد ثلاثي ميثوبريم-سولفاميثوكسيزول في أربعة تركيزات مختلفة من محلول المخزون من 48 × 103 ميكروغرام /مل. C1 = 512 ميكروغرام/مل، V1 = 149.33 ميكرولتر C2 = 1024 ميكروغرام/مل، V1 = 298.66 ميكرولتر C3 = 2048 ميكروغرام/مل، V1 = 597.33 ميكرولتر C4 = 4096 ميكروغرام/مل، V1 = 1 194.66 ميكرولتر</li>
	<li>إزالة حجم محسوب من 14 مل من dH2O العقيمة من كل أنبوب، ومن ثم إضافة الدواء.</li>
	<li>بعد إعداد التركيزات المطلوبة من الدواء الرابع ، خذ 50 ميكرولتر وأضفها إلى الآبار المقابلة بين الصفين B و G والأعمدة 2 و 12 في اللوحات الأربع في اللوحة المقابلة حيث يتوافق C1 مع اللوحة 1 ، C2 يتوافق مع اللوحة 2 ، C3 يتوافق مع اللوحة 3 ، و C4 يتوافق مع اللوحة 4.</li>
</ol>8. إعداد وإضافة البكتيريا inoculum E. القولونية ESBL
<ol><li>باستخدام حلقة معقمة، نقل مستعمرة واحدة من عزل البكتيرية E. coli ESBL سابقا مثقف على طبق من ذهب إلى 2 مل من MHB المعقمة ودوامة.</li>
	<li>تحقق من العكر حيث ينبغي أن يكون 0.5 ماكفارلاند باستخدام عداد الكثافة.</li>
	<li>أضف 80 مل من مرق MH المعقم إلى كوب بول معقم.</li>
	<li>إضافة inoculum البكتيرية من inoculum ماكفارلاند 0.5 إلى كوب البول بعد C1V1 = C2V2, حيث V1 = (106 × 80 مل) / 108 = 800 ميكرولتر.</li>
	<li>ماصة 50 ميكرولتر من محلول inoculum 106 CFU / مل في كل بئر باستثناء H12، وهو التحكم في العقم بشكل جيد.</li>
	<li>احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>بعد الحضانة، إضافة 50 ميكرولتر من Iodotetrazolium لتسجيل النمو في الآبار.</li>
</ol>9. بروتوكول قالب FIC (ملف تكميلي)
<ol><li>اكتب أعلى تركيز للدواء 1 (Cefotaxime) في الخلية الصفراء في اللوحة A.</li>
	<li>اكتب أعلى تركيز للدواء 2 (أميكاسين) في الخلية الصفراء في اللوحة B.</li>
	<li>اكتب أعلى تركيز للدواء 3 (Levofloxacin) في الخلية الصفراء في اللوحة C.</li>
	<li>اكتب أعلى تركيز للدواء 4 (تريميتهوبريم-سولفاميثوكسيزول) في اللوحة D.</li>
	<li>تتبع الخط الأحمر (النمو / لا واجهة النمو) من خلال تسليط الضوء على الآبار وجود نمو باللون الأحمر.</li>
	<li>اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 1 في جدول المخدرات 1 (ATB1).</li>
	<li>اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 2 في جدول المخدرات 2 (ATB2).</li>
	<li>اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 3 في جدول المخدرات 3 (ATB3).</li>
	<li>اكتب هيئة التصنيع العسكري من المخدرات 4 في جدول المخدرات 4 (ATB4).</li>
	<li>لحساب FIC ل ATB1<ol>
<li>تحديد الآبار على واجهة النمو / لا نمو.</li>
		<li>في الجدول ATB1، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة ل FIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة A إلى أول بئر محدد.</li>
		<li>كرر الخطوة 9.10.2 لكل بئر مختارة حيث 1 جيدا يتوافق مع FIC1، حسنا 2 يتوافق مع FIC2، وهلم جرا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لحساب FIC ل ATB2<ol>
<li>في الجدول ATB2، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة لFIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة B إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.</li>
		<li>كرر الخطوة 9.11.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لحساب FIC ل ATB3<ol>
<li>في الجدول ATB3، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة لFIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة C إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.</li>
		<li>كرر الخطوة 9.12.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لحساب FIC ل ATB4<ol>
<li>في الجدول ATB4، انقر نقرا مزدوجا على الخلية المجاورة ل FIC1 واسحب الخلية الصفراء على يسار اللوحة D إلى أول بئر تم تحديده مسبقا.</li>
		<li>كرر الخطوة 9.13.1 لكل بئر تم اختياره مسبقا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>في الجدول المسمى ATB1 +2+3+4، قم بتلخيص FIC1 لكل ATB تلقائيا. نفس سيحدث ل FICs الأخرى (FIC2 FIC3 وهكذا).<ol>
<li>في الخلية التي تحتوي على FIC وأبرز باللون الأصفر، انقر مرتين على ذلك وحدد ΣFICs summed من الجدول ATB1 +2+3+4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>كرر هذه الخطوات لكل ورقة من الأوراق التسعة التي تمثل اللوحات التسعة. ملاحظة: في الورقة FIC كافة، سيعرض الجدول FIC النهائي summed مع تفسير القيمة التي تم الحصول عليها.</li>
</ol>10. تحديد هيئة التصنيع العسكري باستخدام المقايسة microdilution للأدوية الأربعة
<ol><li>تسمية أربعة صفوف مختلفة مع اختصار كل دواء اختبارها. على سبيل المثال، CTX لCefotaxime، AMK لأميكاسين، ليفو لليفوفلوكساسين، وSXT لTrimethoprim-sulfamethoxazole.</li>
	<li>ماصة 200 ميكرولتر من مرق مولر هينتون العقيم إلى رقم جيد 1 ورقم جيد 12 في كل صف المستخدمة. حسنا رقم 12 سيكون بمثابة السيطرة السلبية بشكل جيد.</li>
	<li>ماصة 100 ميكرولتر من مرق مولر هينتون العقيم إلى الآبار 2 حتى 11 في كل صف مستخدم.</li>
	<li>حساب حجم كل دواء تضاف باستخدام الصيغة C1V1 = C2V2. وهكذا، V1 = (C2 × 4 × V2) / C1. V2 هو الحجم النهائي في الآبار وهو 200 ميكرولتر، C1 هو تركيز محلول المخزون، وC2 هو التركيز الأولي الذي نحتاج إلى أن يكون في البئر الأول. ملاحظة: هنا، نستخدم ما يلي: سيفوتيسيم: C1 = 105 ميكروغرام/مل، حيث نقوم بتخفيفه إلى 104 ميكروغرام/مل، C2 = 256 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 20.48 ميكرولتر أميكاسين: C1 = 103 ميكروغرام/مل، C2 = 64 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 51.2 ميكرولتر ليفوفلوكساسين: C1 = 5 × 103 ميكروغرام / مل، حيث تمييعه إلى 5 × 102 ميكروغرام / مل، C2 = 16 ميكروغرام / مل؛ وبالتالي، V1 = 25.6 ميكرولتر تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول: C1 = 48 × 103 ميكروغرام/مل، C2 = 4096 ميكروغرام/مل؛ وبالتالي، V1 = 68.26 ميكرولتر</li>
	<li>ماصة الحجم المطلوب لكل دواء في البئر الأول من الصف المقابل بعد إزالة نفس الحجم من مرق 200 ميكرولتر للحصول على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر بعد إضافة الدواء.</li>
	<li>تمييع تسلسلي عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من البئر 1 إلى بئر 2 وهلم جرا حتى الوصول إلى بئر 10 حيث سيتم التخلص من 100 ميكرولتر إزالتها من البئر 10. لاحظ أن جيدا 11 بمثابة السيطرة الإيجابية بشكل جيد.</li>
	<li>ماصة 100 ميكرولتر من 106 أعدت inoculum البكتيرية في كل بئر في كل صف المستخدمة باستثناء عدد جيد 12 بمثابة السيطرة السلبية.</li>
	<li>حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

يشبه أسلوب "لوحة الداما رباعية" لوحة الداما ولوحة الداما ثلاثي الأبعاد في بروتوكولها. ومع ذلك، ينبغي أخذ بعض الخطوات الحاسمة في الاعتبار لتجنب الأخطاء أثناء التجربة.
تأكد من اختبار لهيئة التصنيع العسكري من كل دواء ضد عزل اختبارها قبل البدء في البروتوكول لمعرفة ما هي التركي?...

مع زيادة المقاومة بسبب الإفراط في استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية1،2، أصبحت الحاجة إلى تطوير أدوية وعوامل جديدة لعلاج العدوى البكتيرية حاسمة. والنهج الجديدة مثل استحداث عقاقير جديدة هامة جدا للتغلب على أزمة المقاومة. ومع ذلك، فإن صناعة الأدوية ليست مهتمة بتطوير عوامل جديدة مضادة للميكروبات. وعلاوة على ذلك، إذا تم تطوير أدوية جديدة، البكتيريا سوف تبقي على تطور وتطوير المقاومة ضد هذه الأدوية الجديدة3،4. وبالتالي، فإن مشكلة المقاومة لن تحل، مما يجعل الحاجة إلى نهج آخر أمرا لا بد منه ينبغي النظر فيه ودراسة التغلب على المقاومة البكتيرية.
مزيج الدواء هو مفهوم مهم جدا لعلاج العدوى البكتيرية أساسا تلك التي تسببها مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة5،6. أنه يقلل من مسار العلاج, يقلل من الجرعة المعطاة; وبالتالي ، فإن تقليل سمية الدواء المعطى ، يساعد في تقليل معدل تطور المقاومة ، وبطريقة ما ، يتحسس البكتيريا بالأدوية المعطاة كما هو موضح في مفهوم الحساسية الجانبية5و7و8و9.
تطوير المقاومة لدواء واحد يتطلب طفرة واحدة; ومع ذلك ، فإن تطور المقاومة لمزيج من الأدوية التي تستهدف مسارات متعددة يتطلب العديد من الطفرات المستقلة التي تتباطأ بسبب هذا المزيج. مثال على انخفاض المقاومة أثناء استخدام العلاج المركب هو انخفاض معدل مقاومة ريفامبين في الميكوباكتريا السل10. مثال آخر هو دراسة أجراها Gribble وآخرون التي أظهرت معدل ظهور سلالات مقاومة في المرضى الذين يتناولون Piperacillin وحدها لتكون أعلى مما كانت عليه في تلك التي تأخذ مزيجا من carboxypenicillin وأمينوغليكوزيد10. وقد أظهرت الدراسات أن تطور المقاومة ل aminoglycosides في البكتيريا المتطورة جعل هذه السلالات حساسة لمختلف الأدوية الأخرى5. الجمع بين بيتا لاكتام فئة المخدرات أموكسيسيلين وحامض اللاكتاماز المانع clavulanic أظهرت نجاحا في علاج السلالات البكتيرية المقاومة8.
تقليل وقت العلاج هو ميزة جيدة ناتجة عن تركيبات المخدرات. على سبيل المثال، فإن العلاج من البنسلين مجتمعة أو سيفترياكسون مع جنتاميسين لمدة 2 أسابيع تعطي نفس الفعالية التي قدمها البنسلين أو سيفترياكسون وحدها عندما تعطى لمدة 4 أسابيع11. الجمع بين الأدوية يسمح لاستخدام جرعات أقل من الأدوية التي ليست فعالة عندما تعطى وحدها مثل البلدان المتوسطة الدخل الفرعية. ويمكن إعطاء مثال السلفوناميدات حيث استخدام السلفوناميدات الثلاثي يقلل، بجرعات أقل، والسمية المنتجة التي هي تشكيل الكريستال أو تبلور عند استخدام السلفوناميدات غير القابلة للذوبان بجرعات كاملة12.
وبالتالي ، فإن تقليل الجرعة المعطاة ووقت العلاج سيقلن في نهاية المطاف من سمية الأدوية على الجسم. فكرة تطوير طرق لتقييم التفاعل بين الأدوية المشتركة مهمة جدا. في إحدى الدراسات، أظهرت النتائج أن العلاج المركب أكثر فعالية لعلاج الأنواع المقاومة من Acinetobacter و P. aeruginosa8.
إعطاء الأدوية في تركيبة هناك طرق مختلفة يمكننا من خلالها دراسة تركيبات المخدرات ، مثل طريقة لوحة الداما ، وطريقة منحنى قتل الوقت ، وطريقة الاختبار الإلكتروني13. يمكن لطريقة لوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين العقارين المعنيين في تجربة واحدة نفسها. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطويره لدراسة مزيج من ثلاثة أدوية14. الآن، ونحن توسيع هذا لدراسة مزيج من أربعة أدوية أساسا لعلاج مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.
عادة ما يتم إجراء المقايسة منحنى قتل الوقت لاختبار تأثير مبيد للجراثيم من دواء معين. كما تم استخدامه لاختبار تأثير تركيبات المخدرات حيث يتم الجمع بين العديد من الأدوية بتركيزات محددة. يتطلب هذا البروتوكول إعداد العديد من الأنابيب أو الأكواب العقيمة حيث نضيف في كل كوب المرق ، مزيج من الأدوية ، والإجهاد البكتيري المطلوب. بعد احتضان وتسجيل الكثافة البصرية في عدة نقاط زمنية ، تتم مقارنة النتائج مع معدل النمو الطبيعي للسلالة المستخدمة لمعرفة ما إذا كان معدل النمو قد زاد أو انخفض أو لم يتغير13.
عادة ما يتم إجراء طريقة الاختبار الإلكتروني لاختبار الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) حيث يتم وضع شريط يحتوي على تركيز متدرجة من الدواء المعني على لوحة تلقيح. كما تم استخدامه لاختبار الجمع بين اثنين من الأدوية حيث يتم إضافة شريطين إلى لوحة بطريقة عمودية تتقاطع في MICsبهم 13.
ووفقا للأدبيات، لا يوجد معيار ذهبي لتحديد التآزر ودراسةه؛ وبالتالي، فإنه من الصعب تقييم أي من الطرق المستخدمة لدراسة الجمع هو أفضل والتي تنتج واحدة نتائج أفضل وأكثر موثوقية أساسا13. ومع ذلك ، فإن الفحص لقتل الوقت كثيف العمالة ، ويستغرق وقتا طويلا ،ومكلفا 15،16، في حين يتم تطوير طريقة الاختبار الإلكتروني لدراسة مزيج بين عقارين فقط. يمكن للوحة الداما دراسة جميع التركيبات الممكنة بين الدواءين المختبرين وهذا هو السبب في اختيار هذه التقنية لتطويرها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

مفهوم العلاج مزيج من الأدوية أصبحت مهمة جدا أساسا مع الزيادة الحادة في مقاومة الأدوية. تهدف لوحة الداما الرباعية، التي تسمى أيضا لوحة الداما Q، إلى تعظيم عدد المجموعات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة لتقليل الوقت والعمل اللازمين لتحقيق نفس النتائج مع بروتوكولات أخرى. ويستند هذا البروتوكول على تقنية التخفيف الدقيق البسيط حيث يتم تخفيف الأدوية ودمجها معا في عدة لوحات 96 بئرا.
في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا ، يضاف مرق Muller-Hinton يليه أول دواء مطلوب (على سبيل المثال ، Cefotaxime هنا) لتخفيفه بشكل متسلسل. بعد الانتهاء من الخطوة الأولى ، يتم استخدام مجموعة أخرى من لوحات 96 بئرا لتمييع الدواء الثاني (على سبيل المثال ، Amikaci) ، والذي سيتم نقله عن طريق إزالة حجم معين من الدواء 2 ووضعه في الآبار المقابلة في المجموعة الأولى من لوحات 96 بئرا تحتوي على الدواء الأول. ويتم تنفيذ الخطوة الثالثة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الثالث (مثل ليفوفلوكساسين) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولية التي تحتوي على مزيج من الدواء 1 و 2. ويتم تنفيذ الخطوة الرابعة بإضافة التركيزات المطلوبة من الدواء الرابع (مثل تريميثوبريم-سولفاميثوكسيزول) إلى الصفائح المناسبة في المجموعة الأولى. ثم، سيتم إعداد E. القولونية ESBL البكتيرية inoculum وإضافتها.
هذه الطريقة مهمة لتقييم جميع التركيبات الممكنة ولها مجموعة أوسع من الاحتمالات لاختبارها بالإضافة إلى ذلك في اختبار الجسم الحي. على الرغم من كونها تقنية متعبة تتطلب الكثير من التركيز ، فإن النتائج رائعة وتوفير الوقت حيث يمكن اختبار الكثير من التركيبات في تجربة واحدة.

يمثل الشكل 2A النتائج التي تم الحصول عليها من خلال الجمع بين سيفوتاكسيم وأميكاسين مع تركيزات محددة من ليفوفلوكساسين وتريمثوبريم-سولفاميثوكسيزول. يمكننا أن نرى في الجزء الأيسر من الشكل لوحات الأربعة التي يتم تقديمها تخطيطيا مع تركيزات المخدرات في الجزء الأيمن من الشكل. تم?...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

يصف هذا البروتوكول كيفية دراسة جميع التركيبات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة. وتستند هذه الطريقة على معيار 96 جيدا لوحة الفحص الدقيق تخفيف وحساب تركيزات مثبطة كسور (FICs) لتقييم النتائج.

رباعية الداما : تعديل لوحة الداما ثلاثية الأبعاد لدراسة تركيبات المخدرات

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

4.4K Views.  University of Balamand. يصف هذا البروتوكول كيفية دراسة جميع التركيبات الممكنة التي يمكن الحصول عليها بين أربعة أدوية في تجربة واحدة. وتستند هذه الطريقة على معيار 96 جيدا لوحة الفحص الدقيق تخفيف وحساب تركيزات مثبطة كسور (FICs) لتقييم النتائج.

Video: Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

رقاقة المستندة إلى خلية ثقافة ثلاثي الأبعاد في المفاعلات الصغيرة Perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

التصنيع الدقيق للرقاقة الحجم السقالات لزراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

أداة تحليلية يحدد مقدار التغييرات الخلوية الصرف من التقاط صور ثلاثية الأبعاد الإسفار

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...