1. שלבי הכנה
<ol><li>הכן מרק מולר-הינטון (MHB) על ידי הוספת 25 גרם מרק MH ל 1 L של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלאב ב 121 °C (69 °F) עבור 2.5 שעות. לאחר מכן, לאחסן את המדיה autoclaved בטמפרטורת החדר או במקרר.</li>
	<li>תת-תרבות החיידקים המדוברים(E. coli ESBL) על מדיה אגר באמצעות שיטת פסים ארבעה רבעים דגירה לילה ב 37 °C (69 °F).<ol>
<li>באמצעות לולאה סטרילית, לקחת מושבה אחת ולהפיץ אותו במחצית הראשונה של צלחת אגר MacConkey על ידי ביצוע פסים מקבילים קרובים.</li>
		<li>באמצעות הלולאה, להפיץ את החיידקים ברביע השני על ידי פסים אותו מהרביע הראשון.</li>
		<li>מהרביע השני, הארך את הפסים ברבע השלישי באמצעות פסים מקבילים קרובים.</li>
		<li>להפיץ את החיידקים במרכז הרבע הרביעי על ידי פסים אותו מן הרבע השלישי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת פאנל
<ol><li>מניחים ארבעה צלחות 96-באר אחד ליד השני כדי ליצור ריבוע. באמצעות קלטת, הדבק את תחתיתם יחד.</li>
	<li>חזור על שלב זה כדי להשיג ארבעה לוחות שכל אחד מהם מכיל 4 לוחות ותן להם שם A1, A2, A3 ו- A4.</li>
	<li>הוסף 50 μL של מרק MH לבארות בין עמודה 2 ועמודה 11 ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של מרק MH לבאר H12 המשמש היטב שליטה שלילית 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.</li>
	<li>הוסף 150 μL של מרק MH לבארות A1 ו- H1 המשמשים בארות בקרה חיוביות ב 16 96-באר צלחות של ארבעת הלוחות.</li>
</ol>3. סמים 1, Cefotaxime, דילול סדרתי
<ol><li>לצינור חרוט, להוסיף 15 מ"ל של dH סטרילי2O.<ol>
<li>לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 15 מ"ל) / C1. הערה: במקרה שלנו, פתרון מניית Cefotaxime הוא 105 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 38.4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסר את הנפח המחושב מ 15 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.</li>
	<li>פיפט 50 μL של פתרון התרופה מוכן לתוך כל באר בעמודה 11 וטור 12 למעט H12.</li>
	<li>התחל את הדילול הטורי על-ידי הסרת 50 μL מעמודה 11 והכנסתו לבארות המתאימות בעמודה 10 ולאחר מכן מ- 10 עד להגעה לעמודה 2 שבה 50 μL שנלקח מעמודה 2 יימחקו.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.4 ו- 3.5 עבור כל 16 לוחות 96-באר של ארבעת הלוחות.</li>
</ol>4. סמים 2, אמקאצ'ין, דילול סדרתי
<ol><li>לצינור חרוט, להוסיף 10 מ"ל של dH סטרילי2O.</li>
	<li>לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 10 מ"ל) / C1. הערה: במקרה שלנו, פתרון מלאי Amikacin הוא 103 מיקרוגרם / מ"ל ו C2 הוא 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 64 μL.</li>
	<li>הסר את הנפח המחושב מ 10 מ"ל של dHסטרילי 2O, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.</li>
	<li>קח שמונה צלחות נפרדות של 96 באר.</li>
	<li>לכל צלחת, להוסיף 100 μL של MHB לבארות בין שורות G ו- B.</li>
	<li>הוסף 100 μL של התרופה שהוכנה בעבר 2 פתרון בארות של שורה G.</li>
	<li>לדלל באופן סדרתי משורה G לשורה B על ידי לקיחת 100 μL מכל באר ולבסוף להשליך את 100 μL מן בארות שורה B.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.5, 4.6 ו- 4.7 כדי להכין שמונה צלחות.</li>
</ol>5. העברת תרופה 2 לארבעת הפאנלים
<ol><li>פיפטה 50 μL של תרופה 2 מן הבארות בין שורות G ו- B לתוך בארות המקביל בכל צלחת בארבעת הלוחות. צלחת אחת מוכנה 96-באר מכיל 100 μL של תרופה 2 זה מספיק עבור שתי צלחות בפאנל אחד.</li>
</ol>6. תרופה 3, לבופלוקסאצין, תוספת
<ol><li>לארבעה צינורות חרוט שונים, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.</li>
	<li>לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1. הערה: במקרה שלנו, Levofloxacin מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל. C1 = 2 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 5.6 μL C2 = 4 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 11.2 μL C3 = 8 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 22.4 μL C4 = 16 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 44.8 μL</li>
	<li>הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O מכל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.</li>
	<li>לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בצלחת המתאימה בכל פאנל שבו C1 מתאים לארבעת לוחות P1 בארבעת הלוחות, C2 מתאים לארבעת לוחות P2 בארבעת הלוחות C3 מתאים לארבעת לוחות ה-P3 בארבעת הלוחות, ו-C4 מתאים לארבעת לוחות ה-P4 בארבעת הלוחות.</li>
</ol>7. תרופה 4, טרימתופרים-סולפטוקסזול, בנוסף
<ol><li>לצינור חרוט, להוסיף 14 מ"ל של dH סטרילי2O.</li>
	<li>לחשב את הנפח שיש להסיר מפתרון המניה של התרופה בעקבות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 14 מ"ל) / C1. הערה: במקרה שלנו, trimethoprim-sulfamethoxazole מוכן בארבעה ריכוזים שונים מפתרון מלאי של 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל. C1 = 512 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 149.33 μL C2 = 1024 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 298.66 μL C3 = 2048 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 597.33 μL C4 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל, V1 = 1 194.66 μL</li>
	<li>הסר את הנפח המחושב מ 14 מ"ל של dH סטרילי2O של כל צינור, ולאחר מכן להוסיף את התרופה.</li>
	<li>לאחר הכנת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית, לקחת 50 μL ולהוסיף אותו בארות המתאימות בין שורות B ו- G ועמודות 2 ו 12 בארבע הצלחות בלוח המתאים שבו C1 מתאים פאנל 1, C2 מתאים פאנל 2, C3 מתאים פאנל 3, ו C4 מתאים פאנל 4.</li>
</ol>8. הכנה ותוספת של אינקולום חיידקי E. קולי ESBL
<ol><li>באמצעות לולאה סטרילית, להעביר מושבה אחת של איזולט חיידקי E. coli ESBL בעבר תרבית על צלחת לתוך 2 מ"ל של MHB סטרילי ומערבולת.</li>
	<li>בדוק את עכירות שבו זה צריך להיות 0.5 מקפרלנד באמצעות מד צפיפות.</li>
	<li>מוסיפים 80 מ"ל של מרק MH סטרילי לתוך כוס שתן סטרילית.</li>
	<li>הוסף inoculum חיידקי מן 0.5 מקפרלנד inoculum לתוך כוס השתן בעקבות C1V1 = C2V2, שבו V1 = (106 x 80 מ"ל) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>פיפטה 50 μL של פתרון inoculum 106 CFU / mL לתוך כל באר למעט H12, שהוא בקרת סטריליות היטב.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 37 °C (60 °F) לילה.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 50 μL של Iodotetrazolium כדי לרשום את הצמיחה בבארות.</li>
</ol>9. פרוטוקול עבור התבנית FIC (קובץ משלים)
<ol><li>כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 1 (Cefotaxime) בתא הצהוב בלוח A.</li>
	<li>כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 2 (Amikacin) בתא הצהוב בלוח B.</li>
	<li>כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 3 (Levofloxacin) בתא הצהוב בלוח C.</li>
	<li>כתוב את הריכוז הגבוה ביותר של תרופה 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) בפאנל D.</li>
	<li>עקוב אחר הקו האדום (ממשק צמיחה/ללא צמיחה) על-ידי הדגשת הבארות שיש להן צמיחה באדום.</li>
	<li>כתוב את המיקרופון של תרופה 1 בטבלה של תרופה 1 (ATB1).</li>
	<li>כתוב את המיקרופון של תרופה 2 בטבלה של תרופה 2 (ATB2).</li>
	<li>כתוב את המיקרופון של תרופה 3 בטבלה של תרופה 3 (ATB3).</li>
	<li>כתוב את המיקרופון של תרופה 4 בטבלה של תרופה 4 (ATB4).</li>
	<li>כדי לחשב FIC עבור ATB1<ol>
<li>קבע את הבארות בממשק הצמיחה/ללא צמיחה.</li>
		<li>בטבלה ATB1, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב בצד שמאל של לוח A לבאר הראשונה שנבחרה.</li>
		<li>חזור על שלב 9.10.2 עבור כל באר שנבחרה כאשר גם 1 מתאים FIC1, גם 2 מתאים FIC2, וכן הלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB2<ol>
<li>בטבלה ATB2, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח B לבאר הראשונה שנבחרה מראש.</li>
		<li>חזור על שלב 9.11.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB3<ol>
<li>בטבלה ATB3, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח C לבאר הראשונה שנבחרה מראש.</li>
		<li>חזור על שלב 9.12.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לחשב את ה- FIC עבור ATB4<ol>
<li>בטבלה ATB4, לחץ פעמיים על התא ליד FIC1 וגרור את התא הצהוב משמאל ללוח D לבאר הראשונה שנבחרה מראש.</li>
		<li>חזור על שלב 9.13.1 עבור כל באר שנבחרה מראש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בטבלה הנקראת ATB1+2+3+4, סכם את ה- FIC1 של כל ATB באופן אוטומטי. אותו הדבר יתרחש עבור FICs האחרים (FIC2, FIC3 וכן הלאה).<ol>
<li>בתא המכיל FIC ומודגש בצהוב, לחץ עליו פעמיים ובחר את ה- ΣFICs המסוכמת מהטבלה ATB1+2+3+4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלבים אלה עבור כל אחד מתשעת הגליונות המייצגים את תשעת הלוחות. הערה: בגיליון FIC כל, הטבלה תציג את FIC סיכם הסופי עם הפרשנות של הערך המתקבל.</li>
</ol>10. קביעת מיקרופון באמצעות מבחני microdilution עבור ארבע התרופות
<ol><li>תווית ארבע שורות שונות עם הקיצור של כל תרופה נבדקה. לדוגמה, CTX עבור Cefotaxime, AMK עבור אמיקצין, LEVO עבור Levofloxacin, ו SXT עבור Trimethoprim-sulfamethoxazole.</li>
	<li>פיפטה 200 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לתוך מספר טוב 1 וגם מספר 12 בכל שורה משומשת. ובכן מספר 12 ישמש כשליטה שלילית היטב.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של מרק מולר הינטון סטרילי לבארות 2 עד 11 בכל שורה משומשת.</li>
	<li>לחשב את הנפח של כל תרופה שיש להוסיף באמצעות הנוסחה C1V1 = C2V2. לכן, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 הוא הנפח הסופי בבארות שהוא 200 μL, C1 הוא הריכוז של פתרון המניה, ו C2 הוא הריכוז הראשוני שאנחנו צריכים להיות בבאר הראשונה. הערה: כאן, אנו משתמשים במילים הבאות: Cefotaxime: C1 = 105 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 104 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 256 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 20.48 μL אמיקצין: C1 = 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 64 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 51.2 μL Levofloxacin: C1 = 5 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, שבו אנו מדללים אותו ל 5 x 102 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 16 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 25.6 μL טרימתופרים-סולפטוקסזול: C1 = 48 x 103 מיקרוגרם / מ"ל, C2 = 4096 מיקרוגרם / מ"ל; לכן, V1 = 68.26 μL</li>
	<li>פיפטה את הנפח הנדרש עבור כל תרופה בבאר הראשונה של השורה המתאימה לאחר הסרת אותו נפח מן מרק 200 μL כדי להשיג נפח כולל של 200 μL לאחר הוספת התרופה.</li>
	<li>באופן סדרתי לדלל על ידי הסרת 100 μL מבאר 1 לתוך גם 2 וכן הלאה עד להגיע גם 10 שבו 100 μL הוסר מבאר 10 יושלכו. שים לב כי גם 11 משמש היטב שליטה חיובית.</li>
	<li>פיפטה 100 μL של 106 inoculum חיידקי מוכן לתוך כל באר בכל שורה משומשת למעט גם מספר 12 המשמש כפקד שלילי.</li>
	<li>דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. C., Dargad, R. R., Borade, D. M., Swami, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+antibiotic+resistance+in+common+infectious+diseases:+role+of+antibiotic+combination+therapy.">Burden of antibiotic resistance in common infectious diseases: role of antibiotic combination therapy.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research: JCDR. 8 (6), (2014).</li><li>Chanda, S., Rakholiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy:+Synergism+between+natural+plant+extracts+and+antibiotics+against+infectious+diseases.">Combination therapy: Synergism between natural plant extracts and antibiotics against infectious diseases.</a> Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. , (2011).</li><li>Cottarel, G., Wierzbowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+drugs,+an+emerging+option+for+antibacterial+therapy.">Combination drugs, an emerging option for antibacterial therapy.</a> Trends in Biotechnology. 25 (12), 547-555 (2007).</li><li>Kristiansen, J., Amaral, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+management+of+resistant+infection+with+non-antibiotics.">The potential management of resistant infection with non-antibiotics.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 40, 319-327 (1997).</li><li>Tamma, P. D., Cosgrove, S. E., Maragakis, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+for+treatment+of+infections+with+gram-negative+bacteria.">Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria.</a> Clinical Microbiology Reviews. 25 (3), 450-470 (2012).</li><li>Leekha, S., Terrell, C. L., Edson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+principles+of+antimicrobial+therapy.">General principles of antimicrobial therapy.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (2), 156-167 (2011).</li><li>Eliopoulos, G. M., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+combinations:+Should+they+be+tested.">Antibiotic combinations: Should they be tested.</a> Clinical Microbiology Reviews. 1 (2), 139-156 (1988).</li><li>Doern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+does+2+plus+2+equal+5?+A+review+of+antimicrobial+synergy+testing.">When does 2 plus 2 equal 5? A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+essential+oil+components+and+antibiotics:+a+review.">Synergy between essential oil components and antibiotics: a review.</a> Critical Reviews in Microbiology. 40 (1), 76-94 (2014).</li><li>Pankey, G., Ashcraft, D., Kahn, H., Ismail, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-kill+assay+and+Etest+evaluation+for+synergy+with+polymyxin+B+and+fluconazole+against+Candida+glabrata.">Time-kill assay and Etest evaluation for synergy with polymyxin B and fluconazole against Candida glabrata.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (10), 5795-5800 (2014).</li><li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

שיטת לוח השחמט המרובע דומה ללוח השחמט ולוח השחמט התלת-ממדי בפרוטוקול שלו. עם זאת, יש לקחת בחשבון צעדים חיוניים מסוימים כדי למנוע שגיאות במהלך הניסוי.
הקפד לבדוק את ה- MIC של כל תרופה נגד איזולט נבדק לפני תחילת הפרוטוקול כדי לדעת מה הם הריכוזים הדרושים כדי להתחיל את הדילול עם תר...

עם העלייה בהתנגדות עקב שימוש יתר ושימוש לרעה שלאנטיביוטיקה 1,2, הצורך לפתח תרופות חדשות וסוכנים לטיפול בזיהומים חיידקיים הפך חיוני. גישות חדשות כגון פיתוח תרופות חדשות חשובות מאוד כדי להתגבר על משבר ההתנגדות. עם זאת, תעשיית התרופות אינה מעוניינת לפתח סוכנים מיקרוביאלית חדשים. יתר על כן, אם תרופות חדשות מפותחות, חיידקים ימשיכו להתפתח ולפתח עמידות נגד תרופות חדשות אלה3,4. לכן, בעיית ההתנגדות לא תיפתר, מה שהופך את הצורך בגישה אחרת חובה שיש לשקול וללמוד כדי להתגבר על עמידות חיידקים.
שילוב תרופות הוא מושג חשוב מאוד לטיפול בזיהומים חיידקיים בעיקר אלה הנגרמים על ידי פתוגנים עמידים multidrug5,6. זה מקטין את מהלך הטיפול, מקטין את המינון שניתן; לכן, הפחתת הרעילות של התרופה הנתונה, מסייעת בהפחתת קצב התפתחות ההתנגדות, ובמובן מסוים, רגישה את החיידקים לתרופות הנתונות כמתואר במושג רגישות בטחונות5,7,8,9.
פיתוח התנגדות לתרופה אחת דורש מוטציה אחת; עם זאת, פיתוח ההתנגדות לשילוב של תרופות המכוונות למסלולים מרובים דורש מספר מוטציות עצמאיות המואטות על ידי שילוב זה. דוגמה לירידה בהתנגדות בעת שימוש בטיפול משולב היא ירידה בשיעור ההתנגדות לריפאמפין בשחפת מיקובקטריום10. דוגמה נוספת היא מחקר שנעשה על ידי Gribble et al. שהראה את קצב הופעתם של זנים עמידים בחולים הנוטלים פייפרצילין לבד להיות גבוה יותר מאשר אלה הנוטלים שילוב של carboxypenicillin ו aminoglycoside10. מחקרים הראו כי התפתחות ההתנגדות aminoglycosides בחיידקים מתפתחים עשה זנים אלה רגישים לתרופות שונות אחרות5. השילוב בין אמוקסיצילין תרופה ברמה בטא לקטם לבין חומצה clavulanic מעכב לקטמה הראההצלחהבטיפול זנים חיידקיים עמידים 8 .
הפחתת זמן הטיפול היא יתרון טוב הנובע משילובי תרופות. לדוגמה, טיפול של פניצילין משולב או ceftriaxone עם gentamicin במשך 2 שבועות ייתן את אותה יעילות שניתנה על ידי פניצילין או ceftriaxone לבד כאשר ניתנת במשך 4 שבועות11. שילוב תרופות מאפשר שימוש במינונים נמוכים יותר של תרופות שאינן יעילות כאשר ניתנות לבד כגון תת MICs. הדוגמה של sulfonamides ניתן לתת שבו השימוש של sulfonamides משולש ממזער, במינונים נמוכים יותר, הרעילות המיוצרת שהיא היווצרות גביש או crystalluria בעת שימוש sulfonamides מסיס במינונים מלאים12.
לכן, הפחתת המינון שניתן ואת זמן הטיפול בסופו של דבר להקטין את הרעילות של התרופות על הגוף. הרעיון של פיתוח שיטות להערכת האינטראקציה בין תרופות משולבות חשוב מאוד. במחקר אחד, התוצאות הראו כי טיפול משולב יעיל יותר לטיפול במינים עמידים של Acinetobacter ו P. aeruginosa8.
מתן תרופות בשילוב ישנן שיטות שונות שבאמצעותן אנו יכולים ללמוד שילובי תרופות, כגון שיטת לוח השחמט, שיטת עקומת זמן להרוג, ואת שיטת E-test13. שיטת לוח השחמט יכולה לחקור את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות המדוברות בניסוי אחד עצמו. בנוסף, הוא פותח כדי ללמוד שילוב של שלוש תרופות14. עכשיו, אנו מרחיבים את זה כדי ללמוד שילוב של ארבע תרופות בעיקר לטיפול של פתוגנים עמידים multidrug.
הבדיקה עקומת להרוג זמן מבוצעת בדרך כלל כדי לבדוק את ההשפעה bactericidal של תרופה מסוימת. זה שימש גם כדי לבדוק את ההשפעה של שילובי סמים שבו מספר תרופות משולבות בריכוזים ספציפיים. פרוטוקול זה דורש הכנה של כמה צינורות סטריליים או כוסות שבו בכל אנו מוסיפים את המרק, שילוב של תרופות, ואת הזן החיידקי הנדרש. לאחר הדגירה והרישום של הצפיפות האופטית במספר נקודות זמן, התוצאות מושוות לקצב הצמיחה הרגיל של הזן המשומש כדי לראות אם קצב הצמיחה גדל, ירד או לא השתנה13.
שיטת בדיקה אלקטרונית נעשית בדרך כלל כדי לבדוק את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) שבו רצועה המכילה ריכוז שיפוע של התרופה המדוברת הוא לשים על צלחת מחוסן. זה שימש גם כדי לבדוק את השילוב בין שתי תרופות שבו שתי רצועות מתווספים לצלחת באופן ניצב מצטלבים ב MICs שלהם13.
על פי הספרות, אין תקן זהב להגדיר וללמוד סינרגיה; לכן, קשה להעריך איזו מהשיטות המשמשות ללימוד שילוב היא טובה יותר ואיזה מהם מייצר תוצאות טובות ואמינות יותר בעיקר13. עם זאת, זמן להרוג assay הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, ויקר15,16, בעוד שיטת E-test מפותחת ללמוד שילוב בין שתי תרופות בלבד. Checkerboard יכול ללמוד את כל השילובים האפשריים בין שתי התרופות שנבדקו ולכן טכניקה זו נבחרה להיות מפותחת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

הרעיון של טיפול בשילוב תרופות הופך להיות חשוב מאוד בעיקר עם עלייה דרסטית בהתנגדות לתרופות. לוח השחמט Quadruple, המכונה גם Q-checkerboard, שואפת למקסם את מספר השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד כדי למזער את הזמן והעבודה הדרושים כדי להשיג את אותן תוצאות עם פרוטוקולים אחרים. פרוטוקול זה מבוסס על טכניקת דילול מיקרו פשוט שבו התרופות מדוללות ומשולבים יחד בכמה צלחות 96-באר.
בסט הראשון של צלחות 96-באר, מרק מולר-הינטון מתווסף ואחריו התרופה הנדרשת הראשונה (למשל, Cefotaxime כאן) כדי לדלל אותו באופן סדרתי. לאחר הצעד הראשון נעשה, קבוצה נוספת של צלחות 96-באר משמש כדי לדלל את התרופה השנייה (למשל, Amikaci), אשר יועברו על ידי הסרת נפח מסוים של תרופה 2 ולשים את בארות המקבילה בסט הראשון של צלחות 96-באר המכיל תרופה אחת. השלב השלישי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה השלישית (למשל, Levofloxacin), ללוחות המתאימים בסט הראשוני המכיל שילוב של תרופה 1 ו -2. השלב הרביעי נעשה על ידי הוספת הריכוזים הנדרשים של התרופה הרביעית (למשל, Trimethoprim-sulfamethoxazol) לתוך הצלחות המתאימות במערכה הראשונה. לאחר מכן, אי קולי ESBL אינוקולום חיידקי יהיה מוכן והוסיף.
שיטה זו חשובה כדי להעריך את כל השילובים האפשריים ויש לו מגוון רחב יותר של אפשרויות להיבדק יתר על כן עבור בדיקות vivo. למרות היותו טכניקה מעייפת הדורשת הרבה מיקוד, התוצאות הן מדהימות וחיסכון בזמן שבו הרבה שילובים ניתן לבחון בניסוי אחד.

איור 2A מייצג את התוצאות המתקבלות על ידי שילוב Cefotaxime ואמיקצין עם ריכוזים ספציפיים של Levofloxacin ו Trimethoprim-sulfamethoxazole. בחלק השמאלי של הדמות ניתן לראות את ארבע הצלחות המוצגות באופן סכמטי עם ריכוזי הסמים בחלק הימני של הדמות. החצים מייצגים את הבארות בממשק צמיחה/ללא צמיחה. בארות צבעוני...

Watch this Scientific Journal Video about Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations at JoVE.com

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.

לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Biology

Unit 1

Pharmacodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

4.4K Views.  University of Balamand. פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור את כל השילובים האפשריים שניתן להשיג בין ארבע תרופות בניסוי אחד. שיטה זו מבוססת על הבדיקה הסטנדרטית של 96 באר צלחת מיקרו דילול וחישוב של ריכוזים מעכבי שבר (FICs) כדי להעריך את התוצאות.

Video: Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...