1. 준비 단계
<ol><li>증류수 1L에 MH 국물 25g을 첨가하여 뮬러-힌튼 국물(MHB)을 준비합니다. 2.5 h에 대한 121 °C에서 오토 클레이브. 그런 다음, 실온이나 냉장고에 오토클레이브 미디어를 저장합니다.</li>
	<li>문제의 박테리아를 서브배양(대장균 ESBL) 4 사분면 줄무늬 방법을 사용하여 천 매체에 37 °C에서 하룻밤 배양.<ol>
<li>멸균 루프를 사용하여, 하나의 식민지를 가지고 가까운 병렬 줄무늬를 수행하여 맥콩키 한천 판의 전반부에 확산.</li>
		<li>루프를 사용하여 첫 번째 사분면에서 줄무늬로 두 번째 사분면에 박테리아를 확산시면 됩니다.</li>
		<li>두 번째 사분면에서 가까운 병렬 줄무늬를 사용하여 세 번째 사분면의 줄무늬를 확장합니다.</li>
		<li>세 번째 사분면에서 그것을 줄무늬로 네 번째 사분면의 중심에 박테리아를 확산.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 패널 준비
<ol><li>사각형을 형성하기 위해 서로 옆에 96 웰 플레이트 4개를 놓습니다. 테이프를 사용하여 바닥을 함께 테이프로 테이프로 붙입니다.</li>
	<li>이 단계를 반복하여 각각 4개의 플레이트를 포함하는 4개의 패널을 구하고 A1, A2, A3 및 A4의 이름을 지정합니다.</li>
	<li>4개의 패널의 16 96웰 플레이트에 2와 열 11 사이의 우물에 MH 국물의 50 μL을 추가합니다.</li>
	<li>4개의 패널의 16 96웰 플레이트에서 음의 대조군역할을 하는 잘 H12에 MH 국물의 200 μL을 추가합니다.</li>
	<li>4개의 패널의 16 96웰 플레이트에서 양성 제어 우물역할을 하는 우물 A1 및 H1에 MH 국물의 150 μL을 추가합니다.</li>
</ol>3. 약물 1, 세포택시, 직렬 희석
<ol><li>원내 튜브에 멸균 dH2O의 15mL를 추가합니다.<ol>
<li>포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 15 mL) / C1. 참고 : 우리의 경우, Cefotaxime 재고 솔루션은 105 μg / mL이고 C2는 256 μg / mL입니다; 따라서, V1 = 38.4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸균 dH2O의 15 mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.</li>
	<li>제조된 약물 용액의 파이펫 50 μL은 H12를 제외한 열(11) 및 열(12)에서 각각 의음으로 들어올 것이다.</li>
	<li>열 11에서 50 μL을 제거하고 열 10의 해당 우물에 넣은 다음 10에서 열 2에서 가져온 50 μL이 폐기되는 열 2에 도달하여 직렬 희석을 시작합니다.</li>
	<li>4개의 패널의 16개의 96웰 플레이트에 대해 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다.</li>
</ol>4. 약물 2, 암카신, 직렬 희석
<ol><li>원내 튜브에 멸균 dH2O의 10mL를 추가합니다.</li>
	<li>포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 10 mL) / C1. 참고: 우리의 경우, Amikacin 재고 용액은 103 μg/mL이고 C2는 64 μg/mL; 따라서, V1 = 64 μL.</li>
	<li>멸균 dH2O의 10mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.</li>
	<li>8 개의 별도 96 웰 플레이트를 가져 가라.</li>
	<li>각 플레이트에 G와 B행 사이의 우물에 100 μL의 MHB를 추가합니다.</li>
	<li>이전에 준비된 약물 2 용액의 100 μL을 행 G의 우물에 추가합니다.</li>
	<li>각 우물에서 100 μL을 복용하여 행 G에서 행 B로 연속적으로 희석하고 마지막으로 행 B의 우물에서 100 μL을 폐기하십시오.</li>
	<li>4.5, 4.6 및 4.7 단계를 반복하여 8개의 플레이트를 준비합니다.</li>
</ol>5. 4 개의 패널에 약물 2의 전송
<ol><li>4개의 패널에 있는 각 플레이트의 해당 우물로 행 G와 B 사이의 우물에서 약물 2의 파이펫 50 μL. 준비된 96웰 플레이트 1개는 1개의 패널에 2개의 플레이트에 충분한 100 μL의 약물 2를 포함합니다.</li>
</ol>6. 약물 3, 레보플로록사신, 추가
<ol><li>4개의 상질형 튜브에 멸균 dH2O의 14mL를 추가합니다.</li>
	<li>포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. 참고 : 우리의 경우, 레보플로록사신은 5 x 103 μg / mL의 재고 용액에서 네 가지 농도로 준비됩니다. C1 = 2 μg/mL, V1 = 5.6 μL C2 = 4 μg/mL, V1 = 11.2 μL C3 = 8 μg/mL, V1 = 22.4 μL C4 = 16 μg/mL, V1 = 44.8 μL</li>
	<li>각 튜브에서 멸균 dH2O의14mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.</li>
	<li>제3 약물의 필요한 농도를 준비한 후, 50 μL을 취하고 C1이 4개의 패널에서 4개의 P1 플레이트에 대응하는 각 패널의 해당 플레이트에 B와 G 및 열 2 및 12 사이의 해당 우물에 추가한 C2는 4개의 패널에서 4개의 P2 플레이트에 해당합니다. , C3는 4개의 패널에서 4개의 P3 플레이트에 대응하고, C4는 4개의 패널에서 4개의 P4 플레이트에 해당한다.</li>
</ol>7. 약물 4, 트리메토림-설파메톡사졸, 추가
<ol><li>원내 튜브에 멸균 dH2O의 14mL를 추가합니다.</li>
	<li>포뮬러 C1V1 = C 2 V2에이어 약물의스톡 용액으로부터 제거되는 부피를 계산한다. 따라서, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. 참고 : 우리의 경우, trimethoprim-sulfamethoxazole의 재고 용액에서 4 개의 다른 농도로 제조 됩니다 48 x 103 μg/mL. C1 = 512 μg/mL, V1 = 149.33 μL C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298.66 μL C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 μL C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL</li>
	<li>각 튜브의 멸균 dH2O의 14mL에서 계산된 부피를 제거한 다음 약물을 추가합니다.</li>
	<li>제4 약물의 필요한 농도를 준비한 후, 50 μL을 취하고 C1이 패널 1에 대응하는 해당 패널의 4개 판에서 B와 G 및 컬럼 2 및 열 2 및 12 사이의 해당 우물에 추가, C2는 패널 2에 대응하고, C3는 패널 에 대응하고, C4는 패널 4에 대응한다.</li>
</ol>8. 세균성 접종 대장균 ESBL의 준비 및 첨가
<ol><li>멸균 루프를 사용하여, 이전에 플레이트상에서 배양된 세균분리 대장균 ESBL의 콜로니 1마리를 멸균 MHB 및 소용돌이2mL로 이송한다.</li>
	<li>밀도계를 사용하여 0.5 McFarland여야 하는 탁도를 확인합니다.</li>
	<li>멸균 된 소변 컵에 멸균 MH 국물의 80 mL을 추가합니다.</li>
	<li>C1V1 = C 2 V2,V1 = (106 x 80 mL) / 10 8 =800 μL에 이어 소변 컵에 0.5 McFarland inoculum에서 세균 접종을 추가합니다.</li>
	<li>피펫 50 μL 의 접종용액(106 CFU/mL)은 H12를 제외한 각 웰에 들어있으며, 이는 멸균 제어가 잘 된다.</li>
	<li>패널을 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 50 μL의 이오도테라졸리움을 추가하여 우물의 성장을 기록합니다.</li>
</ol>9. FIC 템플릿프로토콜(보충 파일)
<ol><li>패널 A의 노란색 셀에 약물 1 (Cefotaxime)의 가장 높은 농도를 작성합니다.</li>
	<li>패널 B의 노란색 세포에 약물 2 (Amikacin)의 가장 높은 농도를 작성합니다.</li>
	<li>패널 C의 노란색 세포에 약물 3 (Levofloxacin)의 가장 높은 농도를 작성합니다.</li>
	<li>패널 D에 약물 4 (트리메토림 - 설파메스톡사졸)의 가장 높은 농도를 작성합니다.</li>
	<li>빨간색으로 성장한 우물을 강조하여 레드라인(성장/성장 인터페이스 없음)을 추적합니다.</li>
	<li>약물 1 (ATB1)의 테이블에 약물 1의 MIC를 작성합니다.</li>
	<li>약물 2 (ATB2)의 테이블에 약물 2의 MIC를 작성합니다.</li>
	<li>약물 3 (ATB3)의 테이블에 약물 3의 MIC를 작성합니다.</li>
	<li>약물 4 (ATB4)의 테이블에 약물 4의 MIC를 작성합니다.</li>
	<li>ATB1에 대한 FIC를 계산하려면<ol>
<li>성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 결정합니다.</li>
		<li>표 ATB1에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 A 왼쪽의 노란색 셀을 잘 선택한 상태로 드래그합니다.</li>
		<li>반복 단계 9.10.2 잘 1 FIC1에 해당 하는 모든 선택 된 잘 에 대 한, 잘 2 FIC2에 해당, 등등.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB2에 대한 FIC를 계산하려면<ol>
<li>표 ATB2에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 B 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.</li>
		<li>미리 선택된 모든 우물에 대해 9.11.1 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB3에 대한 FIC를 계산하려면<ol>
<li>표 ATB3에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 C 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.</li>
		<li>미리 선택된 모든 우물에 대해 9.12.1 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB4에 대한 FIC를 계산하려면<ol>
<li>표 ATB4에서 FIC1 옆셀을 두 번 클릭하고 패널 D 왼쪽의 노란색 셀을 첫 번째 미리 선택된 우물로 드래그합니다.</li>
		<li>미리 선택된 모든 우물에 대해 9.13.1 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB1+2+3+4로 표시된 표에서 각 ATB의 FIC1을 자동으로 합산합니다. 다른 FIC(FIC2, FIC3 등)도 마찬가지입니다.<ol>
<li>FIC를 포함하고 노란색으로 강조 표시된 셀에서 두 번 클릭하고 테이블 ATB1+2+3+4에서 합계된 ΣFIC를 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>9개의 플레이트를 나타내는 9개의 시트 각각에 대해 이 단계를 반복합니다. 참고: 시트 FIC 에서 테이블에는 획득한 값의 해석과 함께 최종 합계 FIC가 표시됩니다.</li>
</ol>10. 4개의 약에 대한 미세 희석 분석기를 이용한 MIC 결정
<ol><li>각 테스트 약물의 약어와 네 개의 서로 다른 행을 레이블. 예를 들어, 세포로메메의 CTX, 아미카신을 위한 AMK, 레보플로생신의 LEVO, 트리메토림-설파메르톡사졸용 SXT.</li>
	<li>멸균 뮬러 힌튼 국물의 파이펫 200 μL은 각 사용된 행에서 잘 번호 1과 잘 번호 12로 국물. 음 넘버 12는 음의 통제역할을 할 것입니다.</li>
	<li>소독 뮬러 힌튼 국물의 파이펫 100 μL은 각 사용된 행에서 2~11개의 우물에 들어있습니다.</li>
	<li>수식 C1V1 = C 2V2를사용하여 추가될 각 약물의 부피를 계산한다. 따라서 V1 = (C2 x 4 x V2)/ C1. V2는 200 μL, C1이 스톡 용액의 농도인 우물의 최종 부피이며,C2는 우리가 처음 우물에서 가져야 할 초기 농도이다. 참고: 여기에서는 다음을 사용합니다. Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, 여기서 우리는 104 μg/mL, C2 = 256 μg/mL로 희석; 따라서, V1 = 20.48 μL 아키카신: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; 따라서, V1 = 51.2 μL Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/mL, 여기서 우리는 5 x 102 μg/mL, C2 = 16 μg/mL로 희석; 따라서, V1 = 25.6 μL 트리메호프프-설파메톡사졸: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; 따라서, V1 = 68.26 μL</li>
	<li>200 μL 국물로부터 동일한 부피를 제거한 후 해당 행의 제1 웰에서 각 약물에 필요한 부피를 피펫하여 약물을 첨가한 후 총 200 μL의 부피를 얻었다.</li>
	<li>100 μL을 잘 1에서 잘 2로 제거하여 100 μL을 잘 2로 제거하여 100 μL을 잘 제거할 때까지 100 μL이 폐기됩니다. 잘 11은 긍정적 인 제어 역할을 잘합니다.</li>
	<li>106의 파이펫 100 μL은 음의 대조군으로 작용하는 우물 번호 12를 제외하고 각 사용된 행에 각각의 우물로 세균 접종을 준비하였다.</li>
	<li>하룻밤 사이에 37 °C에서 배양하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. 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쿼드러플 체커보드 방법은 체커보드와 프로토콜의 3차원 체커보드와 유사합니다. 그러나 실험 중 오류를 방지하기 위해 특정 중요한 단계를 고려해야 합니다.
테스트된 각 약물의 MIC에 대해 테스트해야 하는 프로토콜을 시작하기 전에 플레이트에서 연속적으로 희석되어야 하는 약물 1 및 약물 2에 대한 희석을 시작하는 데 필요한 농도가 무엇인지 알아야 합니다. 약물 3 및 약...

항생제1,2의남용 과용 및 오용으로 인한 저항의 증가와 함께 세균 감염을 치료하기 위한 신약 및 제제를 개발할 필요성이 결정적입니다. 신약 개발과 같은 새로운 접근법은 저항 위기를 극복하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 제약 산업은 새로운 항균제 개발에 관심이 없습니다. 더욱이, 신약이 개발되면 박테리아는 이러한신약3,4에대한 저항을 계속 진화하고 개발할 것이다. 따라서, 저항의 문제는 해결되지 않을 것입니다, 다른 접근에 대한 필요성을 고려하고 세균성 저항을 극복하기 위해 연구해야한다.
약물 조합은 주로 다약물 내성 병원균5,6에의해 유발되는 세균 성 감염을 치료하기위한 매우 중요한 개념이다. 그것은 치료의 과정을 감소, 주어진 복용량을 감소; 따라서, 주어진 약물의 독성을 감소시키고, 저항성의 발병속도를 낮추는 데 도움이 되며, 어떤 면에서, 담보 민감도5,7,8,9의개념에 기술된 바와 같이 주어진 약물에 박테리아를 민감하게 한다.
하나의 약물에 대한 저항 발달은 단일 돌연변이를 필요로한다; 그러나, 여러 경로를 대상으로 하는 약물의 조합에 저항 개발이 조합에 의해 둔화 되는 몇 가지 독립적인 돌연변이 필요. 병용 요법을 사용 하 여 저항감소하는 예는 골균결핵(10)에서리팜핀에 대한 저항률이 감소한다. 또 다른 예는 Gribble 외에 의해 수행 된 연구입니다. 연구 결과에 따르면 진화하는 박테리아에서 아미노글리코사이드에 대한 저항 발달은 이러한 균주를 다양한 다른 약물에 민감하게 만들었습니다5. 베타락탐급 약물 아목시실린과 락타마제 억제제 클라불란산의 조합은 내성세균균제8치료에 성공한 것으로 나타났다.
치료 시간을 줄이는 것은 약물 조합으로 인한 좋은 이점입니다. 예를 들어, 2주 동안 겐타미신을 가진 결합된 페니실린 또는 세프트리악손의 치료는 4주11에주어지면 페니실린 또는 세프트리악손만이 주어지는 것과 동일한 효능을 부여한다. 약물을 결합하면 하위 MiC와 같이 단독으로 투여 될 때 효과적이지 않은 약물의 낮은 복용량을 사용할 수 있습니다. 설포나미드의 예는 삼중 설포나미드의 사용이 최소화되는 경우, 더 낮은 용량으로, 완전투여량12에서불용성 설포나미드를 사용할 때 결정 형성 또는 결정성루리아인 독성을 최소화할 수 있다.
따라서 주어진 복용량과 치료 시간을 줄이면 결국 신체의 약물의 독성이 감소합니다. 결합된 약 사이 상호 작용을 평가하는 방법을 개발하는 아이디어는 아주 중요합니다. 한 연구에서는, 결과는 조합 치료가 아신토박터와 P. aeruginosa8의저항하는 종의 처리를 위해 더 효과적이다는 것을 보여주었습니다.
조합하여 약물을 제공 체크보드 방법, 시간 kill 곡선 방법 및 E-test방법(13)과같은 약물 조합을 연구할 수 있는 다른 방법이 있다. 체크 보드 방법은 하나의 실험 자체에서 문제의 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구 할 수 있습니다. 또한, 3개의약물(14)의조합을 연구하기 위해 개발되었다. 지금, 우리는 주로 다제 내성 병원균의 처리를 위한 4개의 약의 조합을 연구하기 위하여 이것을 확장합니다.
시간 살인 곡선 분석법은 일반적으로 특정 약물의 bactericidal 효과에 대한 테스트 수행. 그것은 또한 여러 약물 특정 농도에서 결합 되는 약물 조합의 효과 대 한 테스트 에 사용 되었다. 이 프로토콜은 각 컵에서 국물, 약물의 조합 및 필요한 세균균을 추가하는 여러 멸균 튜브 또는 컵의 준비를 필요로합니다. 여러 시점에서 광학 밀도의 인큐베이션 및 기록 후, 결과는 사용 된 균주의 정상 성장 속도와 비교하여 성장 속도가 증가, 감소 또는13을변경하지 않았는지 여부를 확인합니다.
전자시험방법은 일반적으로 문제의 약물의 그라데이션 농도를 포함하는 스트립이 접종된 플레이트에 놓이는 최소한의 억제 농도(MIC)를 시험하기 위해 수행됩니다. 또한 두 개의 스트립이 MIC13에서교차하는 수직 방식으로 플레이트에 첨가되는 두 약물 간의 조합을 테스트하는 데 사용되었다.
문학에 따르면, 정의하고 시너지 를 연구하는 금 본위제는 없습니다; 따라서, 조합을 연구하는 데 사용되는 방법 중 어느 것이 더 좋으며 어느 것이 더 좋고 더 신뢰할 수 있는 결과를 주로13을생성하는지 평가하기가 어렵다. 그러나, 시간-살인 분석법은 노동 집약적, 시간 소모,고가의 15,16,E-시험 방법은 두 약물 간의 조합을 연구하기 위해 개발된다. 체커보드는 테스트된 두 약물 사이의 가능한 모든 조합을 연구할 수 있으며, 이것이 이 기술이 개발되기로 선택된 이유입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

약물 조합 요법의 개념은 주로 약물에 대한 저항의 급격한 증가와 함께 매우 중요해지고 있습니다. Q-checkerboard라고도 하는 Quadruple 체커보드는 다른 프로토콜과 동일한 결과를 달성하는 데 필요한 시간과 작업을 최소화하기 위해 한 실험에서 4개의 약물 간에 얻을 수 있는 가능한 조합수를 극대화하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 약물이 희석되고 여러 96 웰 플레이트에서 함께 결합되는 간단한 마이크로 희석 기술을 기반으로합니다.
96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 뮬러-힌튼 국물은 첫 번째 필수 약물(예: Cefotaxime)이 잇따라 첨가되어 이를 연속적으로 희석시합니다. 첫 번째 단계가 완료된 후, 또 다른 96웰 플레이트 세트는 제2약물(예를 들어, 아미카시)을 희석하여 약물 2의 특정 부피를 제거하고 약물을 포함하는 96웰 플레이트의 첫 번째 세트에서 해당 우물에 넣는데 사용된다. 제3단계는 제3약물(예를 들어, 레보플로색사신)의 필요한 농도를 약물 1과 2의 조합을 포함하는 초기 세트의 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행된다. 네 번째 단계는 제 4 약물의 필요한 농도(예를 들어, 트리메토림-설페마페스옥사졸)를 첫 번째 세트에서 적절한 플레이트에 첨가함으로써 수행됩니다. 이어서, 대장균 ESBL 세균성 접종이 준비되고 추가될 것이다.
이 방법은 가능한 모든 조합을 평가하는 것이 중요하며 생체 내 테스트를 위해 더 넓은 범위의 테스트를 테스트할 수 있습니다. 많은 초점을 필요로하는 피곤한 기술임에도 불구하고, 결과는 하나의 실험에서 많은 조합을 테스트 할 수있는 놀라운 시간 절약이다.

도 2A는 세포로메와 아키카신을 레보플로삭신과 트리메호프-설파움톡사졸의 특정 농도를 결합하여 얻은 결과를 나타낸다. 우리는 그림의 오른쪽 부분에 있는 약의 농도와 함께 schematically 제시되는 4개의 판의 왼쪽 부분에서 볼 수 있습니다. 화살표는 성장/성장 없음 인터페이스의 우물을 나타냅니다. 색깔의 우물은 성장을 포함하는 우물입니다. 우리는 네 번째 플레이트가 ?...

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.

쿼드러플-체커보드: 약물 조합을 연구하기 위한 3차원 체커보드 수정

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

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4.4K 조회수.  University of Balamand. 이 프로토콜은 하나의 실험에서 4개의 약 사이에서 얻을 수 있는 모든 가능한 조합을 공부하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 결과를 평가하기 위해 표준 96-웰 플레이트 마이크로 희석 분석 및 분수 억제 농도(FIC)의 계산을 기반으로 한다.

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

연구

생물학

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

입체 세포 배양을위한 칩 크기의 공사장 공중 발판의 Microfabrication

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

시안게이트 모듈형 복제 툴킷을 사용하여 컨쥬게이션에 의한 시아노박테리아의 유전자 변형

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...