1. Fasi di preparazione
<ol><li>Preparare il brodo muller-hinton (MHB) aggiungendo 25 g di brodo MH a 1 L di acqua distillata e mescolare. Autoclave a 121 °C per 2,5 h. Quindi, conservare il supporto autoclavato a temperatura ambiente o in frigo.</li>
	<li>Sottocultura dei batteri in questione(E. coli ESBL) sul supporto dell'agar utilizzando il metodo di striatura a quattro quadranti e incubare durante la notte a 37 °C.<ol>
<li>Usando un ciclo sterile, prendi una colonia e diffondila nella prima metà della piastra di agar MacConkey facendo strette striature parallele.</li>
		<li>Usando il loop, diffondere i batteri nel secondo quadrante striature dal primo quadrante.</li>
		<li>Dal secondo quadrante, estendere le striature nel terzo quadrante utilizzando striature parallele ravvicinate.</li>
		<li>Diffondere i batteri al centro del quarto quadrante striature dal terzo quadrante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione del pannello
<ol><li>Posizionare quattro piatti da 96 po', uno accanto all'altro, per formare un quadrato. Usando un nastro adesivo, rastresere il fondo insieme.</li>
	<li>Ripetere questo passaggio per ottenere quattro pannelli ciascuno contenente 4 piastre e denominarle A1, A2, A3 e A4.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di brodo MH ai pozzi tra la colonna 2 e la colonna 11 nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di brodo MH al pozzo H12 fungendo da pozzo di controllo negativo nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.</li>
	<li>Aggiungere 150 μL di brodo MH ai pozzali A1 e H1 fungendo da pozzi di controllo positivi nelle piastre da 16 96 pozza dei quattro pannelli.</li>
</ol>3. Farmaco 1, Cefotaxime, diluizione seriale
<ol><li>Ad un tubo conico aggiungere 15 ml di dHsterile 2O.<ol>
<li>Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 15 mL) / C1. NOTA: Nel nostro caso, la soluzione di cefotaxime stock è di 105 μg/mL e C2 è di 256 μg/mL; quindi, V1 = 38,4 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il volume calcolato dai 15 mL di dHsterile 2O, quindi aggiungere il farmaco.</li>
	<li>Pipetta 50 μL della soluzione farmacologica preparata in ogni pozzo nella colonna 11 e nella colonna 12 ad eccezione di H12.</li>
	<li>Iniziare la diluizione seriale rimuovendo 50 μL dalla colonna 11 e inserendola nei pozzi corrispondenti nella colonna 10, quindi da 10 fino a raggiungere la colonna 2 dove i 50 μL prelevati dalla colonna 2 verranno scartati.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5 per tutte le 16 piastre da 96 pozzi dei quattro pannelli.</li>
</ol>4. Droga 2, Amkacin, diluizione seriale
<ol><li>A un tubo conico aggiungere 10 ml di dHsterile 2O.</li>
	<li>Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 10 mL) / C1. NOTA: Nel nostro caso, la soluzione stock di Amikacin è di 103 μg/mL e C2 è di 64 μg/mL; quindi, V1 = 64 μL.</li>
	<li>Rimuovere il volume calcolato dai 10 mL di dHsterile 2O, quindi aggiungere il farmaco.</li>
	<li>Prendi otto piatti separati da 96 pozzi.</li>
	<li>Ad ogni piastra, aggiungere 100 μL di MHB ai pozzi tra le file G e B.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL della soluzione di farmaco 2 precedentemente preparata ai pozzi della riga G.</li>
	<li>Diluire serialmente dalla riga G alla riga B prendendo 100 μL da ogni pozzo e infine scartare i 100 μL dai pozzi della riga B.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.5, 4.6 e 4.7 per preparare otto piastre.</li>
</ol>5. Trasferimento della droga 2 ai quattro pannelli
<ol><li>Pipetta 50 μL di farmaco 2 dai pozzi tra le file G e B nei pozzi corrispondenti in ogni piastra nei quattro pannelli. Una piastra preparata da 96 pozzi contiene 100 μL di farmaco 2 che è sufficiente per due piastre in un pannello.</li>
</ol>6. Farmaco 3, Levofloxacina, aggiunta
<ol><li>A quattro diversi tubi conici aggiungere 14 ml di dHsterile 2O.</li>
	<li>Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. NOTA: Nel nostro caso, la levofloxacina viene preparata in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 5 x 103 μg/mL. C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μL C2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μL C3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μL C4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL</li>
	<li>Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dH2O sterile da ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.</li>
	<li>Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del terzo farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le file B e G e le colonne 2 e 12 nella piastra corrispondente in ogni pannello in cui C1 corrisponde alle quattro piastre P1 nei quattro pannelli, C2 corrisponde alle quattro piastre P2 nei quattro pannelli , C3 corrisponde alle quattro piastre P3 nei quattro pannelli e C4 corrisponde alle quattro piastre P4 nei quattro pannelli.</li>
</ol>7. Farmaco 4, Trimethoprim-sulfamethoxazolo, aggiunta
<ol><li>A un tubo conico aggiungere 14 ml di dHsterile 2O.</li>
	<li>Calcolare il volume da rimuovere dalla soluzione stock del farmaco seguendo la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 14 mL) / C1. NOTA: Nel nostro caso, il trimethoprim-sulfamethoxazolo viene preparato in quattro diverse concentrazioni da una soluzione stock di 48 x 103 μg/mL. C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μL C2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μL C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μL C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL</li>
	<li>Rimuovere il volume calcolato dai 14 ml di dHsterile 2O di ogni tubo, quindi aggiungere il farmaco.</li>
	<li>Dopo aver preparato le concentrazioni richieste del quarto farmaco, assumere 50 μL e aggiungerlo ai pozzi corrispondenti tra le righe B e G e le colonne 2 e 12 nelle quattro piastre nel pannello corrispondente dove C1 corrisponde al pannello 1, C2 corrisponde al pannello 2, C3 corrisponde al pannello 3 e C4 corrisponde al pannello 4.</li>
</ol>8. Preparazione e aggiunta di inoculo batterico E. coli ESBL
<ol><li>Utilizzando un anello sterile, trasferire una colonia dell'isolato batterico E. coli ESBL precedentemente coltivato su una piastra in 2 mL di MHB sterile e vortice.</li>
	<li>Verificare la torbidità dove dovrebbe essere 0,5 McFarland utilizzando un densitometro.</li>
	<li>Aggiungere 80 mL di brodo MH sterile a una tazza di urina sterile.</li>
	<li>Aggiungere l'inoculo batterico dall'inoculo di 0,5 McFarland alla tazza di urina dopo C1V1 = C2V2, dove V1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL.</li>
	<li>Pipetta 50 μL della soluzione di inoculo 106 CFU/mL in ogni pozzo ad eccezione di H12, che è il pozzo di controllo della sterilità.</li>
	<li>Incubare i pannelli a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 50 μL di Iodotetrazolium per registrare la crescita nei pozzi.</li>
</ol>9. Protocollo per il modello FIC (file supplementare)
<ol><li>Scrivere la più alta concentrazione del farmaco 1 (Cefotaxime) nella cella gialla nel pannello A.</li>
	<li>Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 2 (Amikacin) nella cella gialla nel pannello B.</li>
	<li>Scrivi la più alta concentrazione del farmaco 3 (Levofloxacina) nella cella gialla nel pannello C.</li>
	<li>Scrivi la più alta concentrazione di farmaco 4 (Trimethoprim-sulfamethoxazole) nel pannello D.</li>
	<li>Traccia la Linea Rossa (interfaccia Crescita/nessuna Crescita) evidenziando i pozzi con crescita in rosso.</li>
	<li>Scrivi il MIC del farmaco 1 nella tabella del farmaco 1 (ATB1).</li>
	<li>Scrivi il MIC del farmaco 2 nella tabella del farmaco 2 (ATB2).</li>
	<li>Scrivi il MIC del farmaco 3 nella tabella del farmaco 3 (ATB3).</li>
	<li>Scrivi il MIC del farmaco 4 nella tabella del farmaco 4 (ATB4).</li>
	<li>Per calcolare il FIC per ATB1<ol>
<li>Determinare i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita.</li>
		<li>Nella tabella ATB1, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello A sul primo pozzo selezionato.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 9.10.2 per ogni pozzo selezionato dove ben 1 corrisponde a FIC1, ben 2 corrisponde a FIC2 e così via.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per calcolare il FIC per ATB2<ol>
<li>Nella tabella ATB2, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello B nel primo pozzo preselezione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 9.11.1 per ogni pozzo preselezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per calcolare il FIC per ATB3<ol>
<li>Nella tabella ATB3, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello C nel primo pozzo preselezione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 9.12.1 per ogni pozzo preselezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per calcolare il FIC per ATB4<ol>
<li>Nella tabella ATB4, fare doppio clic sulla cella accanto a FIC1 e trascinare la cella gialla a sinistra del pannello D nel primo pozzo preselezione.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 9.13.1 per ogni pozzo preselezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nella tabella con l'etichetta ATB1+2+3+4, sommare automaticamente il FIC1 di ogni ATB. Lo stesso accadrà per gli altri TEC (FIC2, FIC3 e così via).<ol>
<li>Nella cella contenente FIC ed evidenziata in giallo, fare doppio clic su di essa e selezionare i ΣFIC sommati dalla tabella ATB1+2+3+4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere questi passaggi per ciascuno dei nove fogli che rappresentano le nove piastre. NOTA: Nel foglio FIC all, la tabella mostrerà il FIC riassunto finale con l'interpretazione del valore ottenuto.</li>
</ol>10. Determinazione MIC utilizzando il saggio di microdiluizione per i quattro farmaci
<ol><li>Etichettare quattro righe diverse con l'abbreviazione di ogni farmaco testato. Ad esempio, CTX per Cefotaxime, AMK per Amikacin, LEVO per Levofloxacina e SXT per Trimethoprim-sulfamethoxazolo.</li>
	<li>Pipetta 200 μL di brodo sterile Muller Hinton in pozzo numero 1 e pozzo numero 12 in ogni riga usata. Bene, il numero 12 servirà bene come controllo negativo.</li>
	<li>Pipetta 100 μL di brodo sterile Muller Hinton ai pozzi da 2 a 11 in ogni fila usata.</li>
	<li>Calcolare il volume di ciascun farmaco da aggiungere utilizzando la formula C1V1 = C2V2. Pertanto, V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 è il volume finale nei pozzi che è di 200 μL, C 1 è la concentrazione dellasoluzione stock, e C2 è la concentrazione iniziale che dobbiamo avere nel primo pozzo. NOTA: Qui, usiamo quanto segue: Cefotaxime: C1 = 105 μg/mL, dove lo diluiamo a 104 μg/mL, C2 = 256 μg/mL; quindi, V1 = 20,48 μL Amikacina: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL; quindi, V1 = 51,2 μL Levofloxacina: C1 = 5 x 103 μg/mL, dove la diluiamo a 5 x 102 μg/mL, C2 = 16 μg/mL; quindi, V1 = 25,6 μL Trimethoprim-Sulfamethoxazolo: C1 = 48 x 103 μg/mL, C2 = 4096 μg/mL; quindi, V1 = 68,26 μL</li>
	<li>Pipettare il volume richiesto per ogni farmaco nel primo pozzo della riga corrispondente dopo aver rimosso lo stesso volume dal brodo da 200 μL per ottenere un volume totale di 200 μL dopo l'aggiunta del farmaco.</li>
	<li>Diluire serialmente rimuovendo 100 μL dal pozzo 1 al pozzo 2 e così via fino a raggiungere ben 10 dove i 100 μL rimossi da ben 10 verranno scartati. Si noti che ben 11 funge da pozzo di controllo positivo.</li>
	<li>Pipetta 100 μL di 106 inoculo batterico preparato in ogni pozzo in ogni riga utilizzata ad eccezione del pozzo numero 12 che funge da controllo negativo.</li>
	<li>Incubare a 37 °C durante la notte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. 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Il metodo Quadruple Checkerboard assomiglia alla scacchiera e alla scacchiera tridimensionale nel suo protocollo. Tuttavia, si dovrebbero prendere in considerazione alcune misure cruciali per evitare errori durante l'esperimento.
Assicurarsi di testare il MIC di ogni farmaco contro l'isolato testato prima di iniziare il protocollo per sapere quali sono le concentrazioni necessarie per avviare le diluizioni con per il farmaco 1 e il farmaco 2 che devono essere diluiti serialmente nelle piastre. Per quanto riguarda il farmaco 3 e il farmaco 4, il MIC dovrebbe anche essere noto per calcolare le concentrazioni necessarie per essere testato (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC e MIC). Ci sono molti metodi per determinare il MIC, ma il meglio è determinarlo con la tecnica di microdiluizione poiché il protocollo Q-checkerboard utilizza anche il test di microdiluizione per la diluizione seriale.
Nel primo passaggio, durante la nastratura delle piastre, assicurarsi che la panca sia pulita e coprire le piastre con coperture sterili per evitare contaminazioni. È importante notare che questo protocollo può essere fatto utilizzando quattro piastre da 96 pozzi che rappresentano i quattro pannelli, dove ogni piastra è divisa in quattro quadranti più piccoli. Tuttavia, il numero di diluizioni sarà ridotto al minimo per il primo e il secondo farmaco. Inoltre, si possono anche utilizzare piastre profonde a 384 pozzi invece di nastrare quattro piastre insieme. Tuttavia, non era disponibile quando abbiamo fatto gli esperimenti. Si noti che quando si sceglie la piastra da utilizzare, assicurarsi di controllare la capacità di ogni pozzo poiché il volume finale nel pozzo sarà di 250 μL.
Inoltre, il numero di piastre in ogni pannello e il numero di pannelli dipende dal numero di diluizioni necessarie per il terzo e il quarto farmaco. Ad esempio, in questo esperimento, sono state richieste quattro diluizioni del terzo farmaco e quattro diluizioni del quarto farmaco (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC e MIC); quindi, avevamo quattro piastre in ogni pannello e quattro pannelli.
La diluizione del primo farmaco si verifica nelle piastre dei pannelli secondo le colonne. Tuttavia, la diluizione del secondo farmaco si verifica in piastre separate in base alle file. Il terzo e il quarto farmaci non vengono diluiti in serie. Tuttavia, ogni concentrazione utilizzata viene preparata in un tubo separato e aggiunta ad ogni pozzo in un volume specifico. È importante notare che i pozzi contenenti i quattro farmaci sono presenti nel quadrante tra le righe G e B e solo le colonne 2 e 12. La scacchiera e i protocolli tridimensionali della scacchiera non sono stati girati o scritti in questo manoscritto perché sono protocolli noti e lo scopo di questo manoscritto è quello di parlare del protocollo Q-checkerboard. Nella tecnica della scacchiera, la riga A contiene solo il farmaco 1; quindi, mostrando il MIC del farmaco 1. La colonna 1 contiene solo il farmaco 2; quindi, mostrando il MIC del farmaco 2.
Questo concetto è mantenuto nel protocollo Q-Checkerboard dove MIC del farmaco 1 è ancora mostrato nella riga A e MIC del farmaco 2 è ancora mostrato nella colonna 1. Inoltre, i due farmaci aggiunti presentano il loro MIC nell'esperimento. Il farmaco 3 ha la piastra P4 in ogni pannello in cui il MIC del farmaco 3 viene aggiunto a tutti i pozzi, quindi non dovremmo osservare la crescita in questa piastra. Allo stesso modo, il farmaco 4 ha pannello A4 in cui il MIC del farmaco 4 viene aggiunto a tutti i pozzi in tutte le piastre nel pannello 4, quindi non dovrebbe essere osservata alcuna crescita in questo pannello.
La crescita delle piastre è registrata in base alla torbidità nei pozzi, dove i pozzi torbidi sono considerati avere crescita. Oltre alla torbidità, 50 μL di Iodotetrazolium vengono aggiunti e lasciati per alcuni minuti. Un cambiamento di colore in rosa significa che c'è crescita.
Questo metodo ha alcune limitazioni. Richiede duro lavoro e concentrazione. Potrebbero verificarsi errori di pipettazione poiché questa tecnica si basa principalmente sulla pipettatura. I calcoli fic sono considerati una limitazione in questo caso poiché abbiamo a che fare con quattro valori non due o tre. L'aggiunta di un valore aumenterà il valore del FIC nel pozzo; pertanto, i valori del FIC che determinano il sinergismo, l'indifferenza e l'antagonismo devono essere riconsiderati.
I valori FIC possono cambiare tra diversi riferimenti riguardanti gli standard con cui sono definiti sinergicismo, antagonismo e indifferenza. Alcuni riferimenti affermano che un FIC di 0,5 e meno è considerato sinergico13, mentre altri affermano che un FIC inferiore a 0,8 è considerato sinergico16. Un altro riferimento afferma che un FIC minore di 1 è considerato sinergico17. A causa dell'instabilità e del conflitto nella definizione di un FIC standard unificato di sinergia, abbiamo considerato 1 come il nostro riferimento.
Il FIC finale è calcolato sommando i valori FIC di ciascuna piastra (9 TEC) e dividendolo per il numero di piastre che è 9. È importante notare che il pannello 4 non è considerato nei risultati poiché contiene il MIC del quarto farmaco, quindi l'inibizione sarà il lavoro di un singolo farmaco. Inoltre, anche la piastra 4 in ogni pannello non viene presa in considerazione poiché contiene il MIC del farmaco 3 in cui l'inibizione in questa piastra sarà l'atto del solo farmaco 3. Quindi, finiamo con 9 piastre (16 - (4 + 3)).
Per ogni piastra, i TEC sono calcolati per i pozzi sull'interfaccia Crescita / nessuna crescita secondo la seguente formula: (MIC del farmaco 1 in combinazione / MIC del solo farmaco 1) + (MIC del farmaco 2 in combinazione / MIC del solo farmaco 2) + (MIC del farmaco 3 in combinazione / MIC del solo farmaco 3) + (MIC del farmaco 4 in combinazione / MIC del solo farmaco 4). Quindi, il numero ottenuto è diviso per 4. Questa formula viene eseguita per ogni pozzo sull'interfaccia Crescita / nessuna crescita nella stessa piastra. Quindi, tutti i TEC della stessa piastra vengono sommati insieme per ottenere il FIC di questa piastra. Infine, come accennato in precedenza, vengono aggiunti e divisi i 9 TEC finali di ciascuna piastra per ottenere il FIC finale che verrà interpretato.
Un FIC minore di 1 è considerato sinergico dove ha un certo grado di sinergia: è leggermente sinergico (vicino a uno) o più sinergico (quando si muove verso 0,5 e meno). Questo calcolo e interpretazione vengono semplicemente eseguiti utilizzando un modello FIC che abbiamo sviluppato. Entriamo solo nelle concentrazioni, scegliamo i pozzi sull'interfaccia Crescita /nessuna Crescita per calcolare i TEC, e otteniamo il FIC finale che viene interpretato secondo i criteri menzionati.
Questo metodo consente di testare tutte le possibili combinazioni che possono essere fatte usando quattro farmaci in un esperimento che possono essere eseguiti in un giorno. I risultati si ottengono il giorno successivo. Mentre, per il saggio della curva di uccisione del tempo, sono necessari più tempo, materiali di lavoro e lavoratori di laboratorio per testare lo stesso numero di combinazioni, poiché ogni insieme di combinazioni viene testato da solo in un singolo tubo o tazza, il che lo rende dispendioso in termini di tempo. Questo metodo può essere utilizzato non solo per testare combinazioni di farmaci antibatterici, ma per testare tutti i tipi di farmaci utilizzati per trattare le malattie e deve essere testato in combinazione. Può essere utilizzato anche per testare una combinazione di farmaci ed estratti vegetali o anche una combinazione di solo estratti vegetali. Il punto è che questo metodo può essere utilizzato per testare non solo farmaci specifici, ma tutto ciò che può essere combinato.
Questo metodo è accompagnato da diverse limitazioni. Le capacità di pipettazione sono molto importanti durante l'esecuzione di questo test e qualsiasi errore che può verificarsi durante la pipettazione e la diluizione seriale può influire negativamente sui risultati e può portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. Pertanto, qualsiasi progresso tecnologico riguardante macchine per pipettatrici e robot sarà di grande aiuto nell'esecuzione di questo saggio. Questo metodo richiede molti calcoli e diluizioni, quindi qualsiasi singolo errore potrebbe modificare il risultato dei risultati. Questa tecnica fornisce approfondimenti solo sull'effetto di inibizione e non sull'effetto di uccisione. Questa tecnica studia l'inibizione in un singolo punto di tempo e non nel tempo.

Con l'aumento della resistenza dovuto all'uso eccessivo e all'uso impropriodi antibiotici 1,2, la necessità di sviluppare nuovi farmaci e agenti per trattare le infezioni batteriche è diventata cruciale. Nuovi approcci come lo sviluppo di nuovi farmaci sono molto importanti per superare la crisi di resistenza. Tuttavia, l'industria farmaceutica non è interessata a sviluppare nuovi agenti antimicrobici. Inoltre, se vengono sviluppati nuovi farmaci, i batteri continuerà a evolversi e sviluppare resistenza contro questi nuovifarmaci 3,4. Pertanto, il problema della resistenza non sarà risolto, rendendo la necessità di un altro approccio un must che dovrebbe essere considerato e studiato per superare la resistenza batterica.
La combinazione di farmaci è un concetto molto importante per il trattamento delle infezioni batteriche principalmente quelle causate da agenti patogeni multifarmaco resistenti5,6. Diminuisce il corso del trattamento, diminuisce la dose somministrata; quindi, diminuendo la tossicità del farmaco dato, aiuta a diminuire il tasso di sviluppo della resistenza e, in un certo senso, sensibilizza i batteri ai farmaci dati come descritto nel concetto di sensibilità collaterale5,7,8,9.
Lo sviluppo della resistenza a un farmaco richiede una singola mutazione; tuttavia, lo sviluppo della resistenza a una combinazione di farmaci mirati a percorsi multipli richiede diverse mutazioni indipendenti che sono rallentate da questa combinazione. Un esempio di diminuzione della resistenza durante l'utilizzo della terapia combinata è la diminuzione del tasso di resistenza a Rifampin in Mycobacterium Tuberculosis10. Un altro esempio è uno studio condotto da Gribble et al. Studi hanno dimostrato che lo sviluppo di resistenza agli amminoglicosidi nell'evoluzione dei batteri ha reso questi ceppi sensibili a vari altri farmaci5. La combinazione tra il farmaco di classe beta-lattame amoxicillina e l'inibitore della lattamasi acido clavulanico ha mostrato successo nel trattamento di ceppi battericiresistenti 8.
Diminuire il tempo di trattamento è un buon vantaggio derivante dalle combinazioni di farmaci. Ad esempio, una terapia di penicillina combinata o ceftriaxone con gentamicina per 2 settimane darà la stessa efficacia data dalla penicillina o dal ceftriaxone da solo se somministrata per 4 settimane11. La combinazione di farmaci consente l'uso di dosaggi inferiori di farmaci che non sono efficaci se somministrati da soli come i Sub-CCI. L'esempio dei sulfonamidi può essere fornito quando l'uso di tre solfamidi riduce al minimo, a dosi più basse, la tossicità prodotta che è la formazione di cristalli o cristalli quando si utilizzano solfonamidi insolubili a dosicomplete 12.
Pertanto, diminuendo il dosaggio dato e il tempo di trattamento alla fine diminuirà la tossicità dei farmaci sul corpo. L'idea di sviluppare metodi per valutare l'interazione tra farmaci combinati è molto importante. In uno studio, i risultati hanno dimostrato che la terapia combinata è più efficace per il trattamento di specie resistenti di Acinetobacter e P. aeruginosa8.
Dare farmaci in combinazione Esistono diversi metodi con cui possiamo studiare le combinazioni di farmaci, come il metodo della scacchiera, il metodo della curva di uccisione del tempo e il metodo di test E13. Il metodo della scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci in questione in un unico esperimento stesso. Inoltre, è stato sviluppato per studiare una combinazione di tre farmaci14. Ora, lo estendiamo a studiare una combinazione di quattro farmaci principalmente per il trattamento di agenti patogeni multirrogatori.
Il test della curva di uccisione del tempo viene solitamente eseguito per testare l'effetto battericida di un certo farmaco. È stato anche usato per testare l'effetto delle combinazioni di farmaci in cui diversi farmaci sono combinati a concentrazioni specifiche. Questo protocollo richiede la preparazione di diversi tubi sterili o tazze in cui in ogni tazza aggiungiamo il brodo, la combinazione di farmaci e il ceppo batterico richiesto. Dopo l'incubazione e la registrazione della densità ottica in diversi punti di tempo, i risultati vengono confrontati con il tasso di crescita normale del ceppo utilizzato per vedere se il tasso di crescita è aumentato, diminuito o non ècambiato 13.
Il metodo di prova elettronica viene solitamente eseguito per verificare la concentrazione inibitoria minima (MIC) in cui una striscia contenente una concentrazione gradiente del farmaco in questione viene messa su una piastra inoculata. È stato anche utilizzato per testare la combinazione tra due farmaci in cui due strisce vengono aggiunte alla piastra in modo perpendicolare intersecandosi ai loroCCI 13.
Secondo la letteratura, non esiste un gold standard per definire e studiare la sinergia; pertanto, è difficile valutare quale dei metodi utilizzati per studiare la combinazione sia migliore e quale produca risultati migliori e più affidabili principalmente13. Tuttavia, il test time-kill richiede molto lavoro, richiede molto tempo ecosta 15,16, mentre il metodo di test E viene sviluppato per studiare una combinazione solo tra due farmaci. La scacchiera può studiare tutte le possibili combinazioni tra i due farmaci testati ed è per questo che questa tecnica è stata scelta per essere sviluppata.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

Il concetto di terapia a combinazione di farmaci sta diventando molto importante principalmente con il drastico aumento della resistenza ai farmaci. La scacchiera Quadruple, chiamata anche Q-checkerboard, mira a massimizzare il numero di possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento per ridurre al minimo il tempo e il lavoro necessari per ottenere gli stessi risultati con altri protocolli. Questo protocollo si basa sulla semplice tecnica di micro diluizione in cui i farmaci vengono diluiti e combinati insieme in diverse piastre da 96 pozzi.
Nel primo set di piastre da 96 pozzi, viene aggiunto brodo Muller-Hinton seguito dal primo farmaco richiesto (ad esempio, Cefotaxime qui) per diluirlo serialmente. Dopo che il primo passo è stato fatto, un altro set di piastre da 96 po 'viene utilizzato per diluire il secondo farmaco (ad esempio, Amikaci), che verrà trasferito rimuovendo un volume specifico di farmaco 2 e messo nei pozzi corrispondenti nel primo set di piastre a 96 po 'che contengono il farmaco uno. Il terzo passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del terzo farmaco (ad esempio, Levofloxacina), alle piastre appropriate nel set iniziale contenenti combinazione di farmaco 1 e 2. Il quarto passo viene fatto aggiungendo le concentrazioni richieste del quarto farmaco (ad esempio, Trimethoprim-sulfamethoxazol) nelle piastre appropriate nel primo set. Quindi, L'inoculo batterico E. coli ESBL verrà preparato e aggiunto.
Questo metodo è importante per valutare tutte le combinazioni possibili e ha una gamma più ampia di possibilità da testare inoltre per i test in vivo. Nonostante sia una tecnica stancante che richiede molta attenzione, i risultati sono notevoli e fanno risparmiare tempo dove molte combinazioni possono essere testate in un singolo esperimento.

La figura 2A rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Notiamo che la quarta piastra non contiene crescita nel quadrante contenente la combinazione. Questo perché in questa piastra abbiamo il MIC di Levofloxacina che inibisce la crescita. In questa figura, possiamo vedere che il MIC del Cefotaxime è ottenuto nel pozzo A8, che è uguale a 32 μg/mL. Il MIC di Amikacin è ottenuto nel pozzo E1, che è uguale a 16 μg/mL. Un effetto di inibizione è visto nella fila contenente 1/2 MIC di Amikacin (riga D) oltre a diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/8 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Questa inibizione della crescita batterica in pozzi contenenti concentrazioni subMIC potrebbe essere una forma di sinergia tra queste concentrazioni dei quattro farmaci.
La figura 2B rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Nel pannello rappresentato da questa figura, possiamo vedere che il modello di inibizione della crescita batterica si è verificato anche nella riga D, dove i pozzi contengono subMIC di Cefotaxime e levofloxacina, 1/2 MIC di Amikacin e 1/4 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole.
La figura 2C rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. I pozzi colorati sono i pozzi che contengono crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Per quanto riguarda il modello di inibizione in questo pannello, possiamo vedere che nelle righe C e D la crescita non è vista. Ciò significa che nei pozzi contengono diversi subMIC di Cefotaxime e Levofloxacina oltre a 1/2 MIC di Trimethoprim-sulfamethoxazole e 1/4 MIC e 1/2 MIC di Amikacin.
La figura 2D rappresenta i risultati ottenuti combinando Cefotaxime e Amikacin con concentrazioni specifiche di Levofloxacina e Trimethoprim-sulfamethoxazolo. Possiamo vedere nella parte sinistra della figura le quattro placche che sono schematicamente presentate con le concentrazioni dei farmaci nella parte destra della figura. Le frecce rappresentano i pozzi sull'interfaccia Crescita/nessuna crescita. Seguire la stessa interpretazione per la quarta piastra. Possiamo vedere che solo nella riga A e nella colonna 1 abbiamo pozzi colorati che significano crescita. Questo perché in questo pannello abbiamo il MIC di trimethoprim-sulfamethoxazolo che inibisce totalmente la crescita.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62311/62311fig02.jpg"> Figura 2: Risultati sperimentali ottenuti nella prova 1 per alcune combinazioni testate. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62311/62311fig02large.jpg" target="_blank">cifra.</a>
File supplementare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62311/supplemental%20file.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

Questo protocollo descrive come studiare tutte le possibili combinazioni che possono essere ottenute tra quattro farmaci in un unico esperimento. Questo metodo si basa sul saggio standard di micro diluizione a piastre da 96 pozzi e sul calcolo delle concentrazioni inibitorie frazionarie (COV) per valutare i risultati.

Quadruple-Checkerboard: una modifica della scacchiera tridimensionale per lo studio delle combinazioni di farmaci

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

quadruple-checkerboard-modification-three-dimensional-checkerboard

Nanyang Technological University

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

Basato su chip tridimensionale coltura cellulare in perfuso Micro-bioreattori

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: un metodo per studiare l&#39;architettura tridimensionale dei genomi.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uno strumento di analisi che quantifica Modifiche morfologia cellulare dalle immagini a fluorescenza tridimensionali

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Utilizzando ad alta risoluzione Tomografia Computerizzata Per visualizzare la struttura tridimensionale e funzione delle piante Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging in idrogel tridimensionali

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Risoluzione a una cellula di immagini tridimensionali di organoidi intatti

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...