شالوم.نظام مراسل BW تمكن من دراسة التفاعلات مستقبلات ligand. ومن المفيد للغاية في الحالات التي يكون فيها يغاند مستقبلات معينة غير معروف أو في الحالات التي تكون فيها التجارب مع ليغاند الذاتية صعبة من الناحية الفنية. هذه الطريقة حساسة ومحددة لمستقبلات الفردية، وسهلة التشغيل وتكرار.
إثبات الإجراء سيكون شيرا كالون، وهو ما بعد الدكتوراه لمختبري. في اليوم السابق لtransfection، لوحة 10 لوحات مع 10 ملليلتر من 100، 000 BW5147 الخلايا، وتكملة لPMI. ثم ضع 100 ميكروغرام من pcDNA3 plasmid في أنبوب.
إضافة خلات الصوديوم في 5.3 الأسي إلى الأنبوب. بعد ذلك، إضافة 2.5 وحدات تخزين من 100٪ الإيثانول إلى خليط البلازميد. ثم احتضان خليط البلازميد بين عشية وضحاها في ناقص 20 درجة مئوية.
بعد 24 ساعة من طلاء خلايا BW، قم بجمع الخلايا في أنبوبين 50 ملليلتر. ثم الطرد المركزي الخلايا في 515 ز لمدة خمس دقائق، والتخلص من الفائق. إعادة تعليق في بيلوتون RPMI دون إضافات وتكرار الطرد المركزي.
Resuspend بيليه الناتجة في 1 ملليلتر من RPMI دون إضافات. نقل بيليه resuspended إلى 4 سم cuvet على الجليد. الطرد المركزي البلازميد التي خضعت لهطول الأمطار الإيثانول.
ثم غسل البلازميد مع ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول. وكرر الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة أخرى. إزالة كل من الإيثانول، والسماح بيليه لتجف جزئيا.
ثم إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من RPMI مسخ مسبقا، دون إضافات. بعد ذلك، إضافة البلازميد resuspended إلى الخلايا في cuvet. احتضان الخلايا على الجليد لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك، الكهربائي الخلايا. ثم نقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب 50 ملليلتر. إضافة 50 ملليلتر من المتوسط الكامل للأنبوب والطرد المركزي لمدة خمس دقائق، في 515 غرام.
تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 50 ملليلتر من المتوسط الكامل. ثم قم بطبق الخلايا في أطباق ثقافة 24 بئرًا ، واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة. بعد هذا، إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل، تستكمل مع 10 ملليغرام لكل ملليلتر من G418 إلى كل بئر.
48 ساعة في وقت لاحق، والتخلص من ملليلتر واحد من حجم أعلى من كل بئر. ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل تكملها خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من G418 إلى كل بئر. استخدام 000 50 خلية من خلايا بي دبليو المُصابة بالعدوى مع أهدافها المنشودة، في بئر واحد من صفيحة 96 بئراً.
احتضان لوحة لمدة 48 ساعة. ثم تجمدي الصفيحة عند 20 درجة مئوية معطف لوحة ELISA مع المضادة الماوس IL-2 الأجسام المضادة.
مكان 05 ميكروغرام من المضادة للماوس IL - 2 ، في حجم 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في كل بئر. احتضان لوحة المغلفة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. استخدام فترة حضانة قصيرة عند 37 درجة مئوية، لإذابة خلايا BW المجمدة، التي كانت في السابق تحتضن مع أهدافها.
ثم الطرد المركزي لوحة، ونقل 100 ميكرولترات من عظمى من كل بئر إلى لوحة ELISA المغلفة مسبقا. و احتضنت 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد هذا إضافة البيوتين المضادة للماوس IL-2 إلى لوحة ELISA.
ثم بعد الحضانة والغسيل، إضافة HRP متقارن streptavidin إلى لوحة. بعد الحضانة والغسيل، أضف 100 ميكرولترات من محلول الركيزة TMB، إلى كل بئر من لوحة ELISA. وأخيرا قراءة لوحة ELISA في 650 نانومتر.
في هذا المثال، كانت خلايا CLL محتضنة مسبقاً مع أجسام مضادة لـ CD20 مختلفة. ثم شارك في احتضان مع خلايا BW المصابة التي تعبر عن مستقبلات FC CD16، قبل أن يتم تحليل مع ELISA. بعد التحليل مع ELISA تم تحديد النتائج كميا.
تم تحويل مستويات الكثافة البصرية، إلى تركيزات الماوس IL-2، استنادا إلى المنحنى القياسي. في تجربة إضافية، كانت جرعات مختلفة من الأجسام المضادة لـ CD20 محتضنة مسبقًا مع خلايا CLL. ثم احتضان مع خلايا BW المصابة.
يحتوي الجسيم على أربعة أجزاء رئيسية. الاستنساخ، نقل خلايا BW، التنشيط و ELISA. وينبغي التحقق من كل جزء من الأجزاء بشكل مستقل.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية مع الخلايا التي تعبر عن مستقبلات الذاتية، مثل قتل الأحماض مع خلايا NK لدراسة التفاعلات مع مستقبلات الخلايا NK. لقد استخدمنا هذا النظام لاكتشاف يغاندس جديدة من مستقبلات الخلايا NK. على سبيل المثال، هيماغلوتينين هو يغاند من NKp46، و PVL هو يغاند من TG.
