الخلايا الجذعية الدبقية هي مجموعة فرعية من الخلايا في الورم الدبقي ، والتي عادة ما تكون مقاومة للعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي. هنا وصفنا طريقة التحديد السريع للعلاجات المركبة ، واستهداف الخلايا الجذعية الورم الدبقي ، بدلا من الخلايا الدبقية المتمايزة. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب ، والتي قد تكون شاقة ومعقدة.
هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا وسريع، لتحديد تركيبات المخدرات مفيدة محتملة. ابدأ بجمع الخلايا الجذعية الدبقية أو GSCs من وسيط الثقافة ، والطرد المركزي عند 70 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة supernatant، هضم الخلايا مع accutase لمدة أربع دقائق في 37 درجة مئوية.
باستخدام طرف 200 ميكرولتر، ماصة الخلايا مرارا وتكرارا للتفكك، وإعادة إنفاق بيليه الخلية. أضف GSCs بكثافة 200,000 خلية في ملليلتر واحد من وسيط الثقافة ، إلى كل بئر من لوحة ثقافة الآبار ال 12 ، واحتضانها بين عشية وضحاها. أوه في اليوم التالي ، إضافة 30 ميكرولتر من فيروس لوسيفيراز - eGFP supernatant في كل بئر من لوحة.
الطرد المركزي الخلايا في 1000 مرة G لمدة ساعتين، في 25 درجة مئوية واحتضانها بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، استبدل الوسط في الآبار بجمع GSCs، والطرد المركزي منها، وإزالة الناموس، وإعادة إنفاقها في وسط جديد، وإعادة صياغتها. ثقافة الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.
مراقبة لوحة تحت المجهر الفلورسنت وتأكيد ظهور الخلايا إيجابية GFP. فرز وجمع GSCs مع مضان عالية باستخدام فرز خلية تدفق والثقافة لهم كذلك. معطف، 96 لوحات أسفل البصرية جيدا مع خليط مصفوفة خارج الخلية، مثل matrigel، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
إزالة الخليط الزائد وشطف بلطف لوحات مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم البذور XG387-لوك الخلايا في كثافة 1000 خلية في 100 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة، وإلى كل بئر من لوحات المغلفة والثقافة لهم بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، مراقبة الخلايا تحت المجهر لتأكيد تعلقها لوحة. المقبل إعداد 200 ميكرومولار تيموزولوميد الحل واثنين من حلول الميكروفولار من العوامل المستهدفة، في وسط الثقافة.
لفحص المخدرات الجمع، وإزالة المتوسطة فارغة وإضافة المتوسطة التي تحتوي إما 200 تيموزولوميد ميكرومولار أو اثنين من الكائنات الدقيقة المستهدفة عامل، أو مزيج من كليهما، في كل بئر لثلاثة تكرارات التقنية لكل علاج. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. التقاط صور للإضاءة الحيوية الخلوية في لوحة باستخدام نظام التصوير الطيف IVIS.
باستخدام البرمجيات المدمج في، وخلق مناطق دائرية متعددة من المنطقة ذات الاهتمام وتحديد الإضاءة الحيوية الخلوية. لتحديد المرشحين المحتملين التي يمكن أن تعزز تأثير الورم الأرومي الأنجليوومي من تيموزولوميد، تم تحليل 20 مثبطات جزيء صغير انتقائية الهدف من خلال فحص تركيبة المخدرات. وكانت قيم المؤشر الحساسة ل 13 وكيلا مستهدفا أعلى من الصفر وخمسة منها أعلى من 0.1.
وكان المؤشر الحساس لأكبر عقارين مرشحين UMI-77 و A 83-01 أعلى من 0.25 ، مما يشير إلى إمكاناتهما للتآزر مع تيموزولوميد. تم تقييم العلاج المشترك للتيموزولومايد وUMI-77 باستخدام م المقايسة المضادة للتكاثر في مصفوفة المعايرة ستة في ست جرعات. قيم الفهرس المركبة كانت أقل من واحد.
وكانت قيم العامل الواحد العالية أكبر من الصفر بالنسبة لمعظم تركيبات تيموزولوميد وUMI-77 بتركيزات مختلفة. مما يشير إلى تفاعل تآزري شامل بين تيموزولوميد وUMI-77 في كل من XG387 وXG328 GSCs. ويمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول في العثور على تركيبة المخدرات باستخدام الخلايا السرطانية الملتصقة ببساطة عن طريق إزالة لوحة طلاء الخطوة.
